Optične lastnosti bioloških mikroskopov
Optična zmogljivost mikroskopa je določena z naslednjimi osmimi osnovnimi optičnimi parametri (ali parametri):
(1) Numerična apertura
Numerična apertura se imenuje tudi zrcalno razmerje. Nanaša se na zmnožek lomnega količnika n medija med opazovanim predmetom in lečo ter vrednosti sinusa polovice kota leče objektiva. Za predstavitev uporabite NA ali A. NA{0}}nsin( /2)
Tako imenovani kot ustja zrcala se nanaša na kot med robnimi žarki opazovane točke, ki vstopajo v sprednjo lečo objektiva.
Numerična apertura je pomemben parameter leče objektiva in zbiralne leče ter je tesno povezana z drugimi optičnimi parametri mikroskopa. Na splošno velja upanje, da večji kot je, tem bolje. Iz formule je razvidno, da obstajata dva načina za povečanje numerične aperture, eden je povečanje kota ustja ogledala, drugi pa povečanje lomnega količnika med lečo objektiva in vzorcem.
Če uporabimo prvo metodo, sta lahko vzorec in predmet čim bližje. Toda ne glede na to, kako blizu je, je vedno manj kot 180 stopinj. Tako je tudi sin( /2) manjši od 1. Lomni količnik zraka je n=1. Zato je numerična zaslonka nsin( /2) leče suhega objektiva vedno manjša od 1, na splošno med 0,04 in 0,95.
Pri slednji metodi se lahko med lečo objektiva in vzorec doda medij z višjim lomnim količnikom. Na primer, lomni količnik cedrinega olja je n=1,515. Če kot medij uporabimo cedrovo olje, lahko numerična apertura doseže več kot 1,2. Zato se v nekaterih primerih uporabljajo oljna očala. Trenutno je največja numerična zaslonka, ki jo lahko doseže oljna leča, 1,4.
(2) Resolucija
Ločljivost se imenuje tudi stopnja ločevanja ali moč ločevanja. Tako imenovana ločljivost se nanaša na sposobnost mikroskopa, da razloči fino strukturo pregledanega predmeta. Je obratno sorazmerna z razdaljo ločljivosti. Razdalja ločljivosti se nanaša na najmanjšo razdaljo med dvema točkama objekta, ki ju je mogoče razlikovati. Manjša kot je razdalja ločljivosti, večja je ločljivost mikroskopa. Če je razdalja med dvema točkama predmeta manjša od razdalje ločljivosti, bosta točki zamenjani za eno točko in njene strukture ni mogoče jasno videti. Ločljivost mikroskopa določa leča objektiva. Okularji samo povečajo in ne povečajo ločljivosti mikroskopa.
V primeru normalne sredinske osvetlitve je ločevalna razdalja d leče objektiva določena z naslednjo formulo.
d=(λ/2)N.A.
V formuli: d predstavlja razdaljo ločljivosti, enota je mikron, λ predstavlja valovno dolžino osvetljevalne svetlobe, enota je prav tako mikron.
V vidni svetlobi je valovna dolžina z največjo svetlostjo in največjo občutljivostjo za človeške oči {{0}},55 μm, največja NA leče objektiva pa 1,4. Če nadomestimo zgornjo formulo, je d približno 0,2 μm. To pomeni, da je pri navadnem optičnem mikroskopu meja razdalje ločljivosti 0.2 μm v primeru centralne osvetlitve. To pomeni, da običajni optični mikroskopi ne morejo razlikovati med dvema predmetoma, manjšima od 0,2 μm.
Z uporabo ultravijolične svetlobe je mogoče zmanjšati valovno dolžino osvetljevalne svetlobe, kar omogoča, da razdalja ločljivosti doseže 0,1 μm. Toda ultravijoličnih žarkov človeško oko ne more videti. Opaziti ga je mogoče šele po fotografiranju.
Valovna dolžina toka elektronov je le 0,00387nm. Z uporabo "elektronske leče" ali magnetne leče za nadzor pretoka elektronov je razdalja ločljivosti elektronskega mikroskopa do nekaj desetink nanometra. Uporablja se lahko za opazovanje zgradbe atomov.
(3) Povečava
Povečava mikroskopa je enaka produktu povečave leče objektiva in povečave okularja. Načeloma lahko povečavo naredimo zelo veliko. Če pa leča objektiva ne more razločiti podrobnosti vzorca, je nesmiselna, ne glede na to, kako velika je povečava. Teoretično je mogoče sklepati, da je najprimernejša povečava mikroskopa (imenovana efektivna povečava, ki jo dejansko predstavlja M) med 500- in 1000-kratno numerično odprtino leče objektiva. To je 500N.A. Manjši ali enak M efektivno Manjši ali enak 1000N.A.
Znotraj območja učinkovite povečave lahko oči opazujejo dolgo časa brez utrujenosti. Če je povečava manjša od 500 NA, bo opazovanje težko. Če je višji od 1000N.A., bo to poslabšalo kakovost slike in celo povzročilo neresnično sliko. Zato je povečava nad 1000N.A. se imenuje neveljavna povečava.
(4) Delovna razdalja
Delovna razdalja se nanaša na razdaljo med spodnjo površino leče objektiva in zgornjo površino pokrovnega stekla po fokusiranju mikroskopa z uporabo standardnega pokrovnega stekla in standardne dolžine mehanske cevi. Večja kot je povečava leče objektiva, krajša je delovna razdalja. Na splošno je delovna razdalja objektiva z nizko močjo pod 10-krat 5-7 mm, medtem ko je delovna razdalja 100-kratne oljne leče le približno 0,19 mm.
(5) Globina fokusa
Ko je mikroskop fokusiran na določeno ravnino v preparatu, ni jasno vidna samo ravnina predmeta, ampak se hkrati jasno vidita tudi zgornja in spodnja ravnina predmeta, ki sta povezani z njo. Razdalja med zgornjo in spodnjo ravnino objekta se imenuje globina fokusa ali na kratko globina fokusa.
Globina fokusa mikroskopa je zelo majhna in večja kot je numerična odprtina, večja je skupna povečava in manjša je globina fokusa. Na primer, pri uporabi oljne leče z NA 1,25/100-krat in 12,5-kratnim okularjem za opazovanje je globina ostrenja le 0,27 μm. To pomeni, da je po fokusiranju naenkrat jasno vidna le tanka plast debeline 0,27 μm. Navadni primerki so običajno debeli več mikronov. Če želite videti celoten vzorec, je treba uporabiti mehanizem za fino nastavitev mikroskopa za opazovanje v plasteh od zgoraj navzdol.
(6) vidno polje
Vidno polje imenujemo tudi vidno polje. Nanaša se na obseg pregledanega predmeta, ki ga mikroskop lahko vidi naenkrat. Običajno želimo, da je vidno polje čim večje. Vidno polje mikroskopa je določeno z vidnim poljem leče objektiva in vidnim poljem okularja. Vidno polje običajne leče objektiva je manjše od 20 mm, velike pa lahko dosežejo več kot 40 mm. Vidno polje navadnih 10x okularjev je 14 mm, pri velikih pa lahko dosežejo tudi več kot 24 mm. Ko sta objektiv in okular zasnovana, je njuno vidno polje določeno. Ker je vidno polje splošnega mikroskopa majhno, je nemogoče videti celotnega preparata v enem vidnem polju, viden je le zelo majhen krog na preparatu. Poleg tega je velikost vidnega polja obratno sorazmerna s skupno povečavo mikroskopa. Večja kot je skupna povečava, manjše je vidno polje. Rešitev je, da uporabite premikalo, da vsak del vzorca izmenično vstopi v vidno polje in opazuje.
(7) Zrcalna svetlost
Zrcalna svetlost se nanaša na svetlobo in temnost slike predmeta, ki jo vidimo v mikroskopu. Zaradi lažjega opazovanja upamo, da bo nastala slika svetlejša. Pri stalni zunanji svetlobi je svetlost ogledala sorazmerna s kvadratom numerične odprtine in obratno sorazmerna s kvadratom celotne povečave. Da bo slika svetlejša, je treba z okularjem z majhno povečavo uporabiti lečo objektiva z veliko numerično zaslonko. Na primer, v primeru iste leče objektiva bo uporaba 5X okularja ustvarila zrcalno sliko, ki je 4-krat svetlejša kot uporaba 10X okularja.
Pri mikroskopih, ki uporabljajo električne vire svetlobe, lahko svetlost zrcalne slike nadzirate s prilagajanjem svetlosti osvetljevalnika.
(8) Jasnost
Jasnost slike mikroskopa je odvisna od njegovega optičnega sistema, zlasti od optične zmogljivosti leče objektiva. Povezan je z zasnovo, proizvodnjo, uporabo in shranjevanjem mikroskopov. Gre za pomembno in kompleksno vprašanje. Z vidika uporabe in shranjevanja so glavni razlogi, ki vplivajo na jasnost: debelina uporabljenega pokrovnega stekla je neprimerna, ostrenje ni nastavljeno na idealen položaj, skupna povečava je prevelika in leča olja leča ni obrisana. Čisto, plesen na lečah itd.
