Koliko veste o fluorescenčni mikroskopiji
Fluorescenčni mikroskopi običajno uporabljajo visokointenzivne živosrebrne žarnice kot vire vzbujalne svetlobe. Filtri se uporabljajo za filtriranje neželene svetlobe, pri čemer ostane samo visokointenzivna, čista svetloba, ki vzbudi fluorofor. Ko monokromatska svetloba obseva vzorec skozi lečo objektiva, bo vzorec vzburjen za oddajanje svetlobe (fluorescenca), tako fluorescenca kot vzbujalna svetloba se bosta vrnili po optični poti leče objektiva. V tem primeru je potrebno dihroično ogledalo za filtriranje vzbujalne svetlobe. , tako da lahko vidimo le fluorescenco, ki jo potrebujemo.
Ta fluorescenca doseže okular po svetlobni poti mikroskopa in nato vstopi v naše oči, kjer lahko vidimo fluorescenco, ki jo oddaja fluorofor.
Predhodna kontrola in nastavitev fluorescenčnega mikroskopa:
(1) Pred vsakim opazovanjem fluorescence je treba rutinsko preveriti poravnavo žarilne nitke, fokus optične poti, diafragmo zaslonke in nastavitve poljske diafragme fluorescenčne naprave.
(2) Ali je bil v pretvornik nameščen zahtevani sklop filtra za vzbujanje/oddajanje fluorescence, ali je leča objektiva fluorescenčnega mikroskopa pravilno konfigurirana in odstranite oljne madeže in prah na sprednji leči leče objektiva.
(3) Če se hkrati izvaja faznokontrastno opazovanje prepustne svetlobe, je treba preveriti konjugacijo središča kondenzorja in faznokontrastnega obroča nasproti leče objektiva.
(4) Preverite, ali je nosilec vzorca (predmetno steklo, pokrovno steklo in drugi pripomočki) prekrit s tekočino ali prahom in ali je debelina znotraj kalibriranega območja delovne razdalje leče objektiva. Narezan vzorec ne sme biti predebel, po možnosti manj kot ali enak 10 μm.
(5) Ker vir svetlobe vsebuje ultravijolične žarke, je nad sprednjo stran mize nameščena rjava plošča za zaščito pred svetlobo, ki preprečuje, da bi ultravijolični žarki poškodovali mrežnico.
(6) Nestabilnost napetosti bo skrajšala življenjsko dobo visokotlačne živosrebrne žarnice, napajalnik svetlobnega vira pa je opremljen s stabilizatorjem napetosti.
(7) Da bi podaljšali življenjsko dobo živosrebrne sijalke, jo lahko izklopite 15 minut po vklopu; ko je fluorescentna moč živosrebrne sijalke izklopljena, je treba počakati vsaj 10 minut, da se živosrebrne pare znova zaženejo, da se ohladijo in vrnejo v prvotno stanje, sicer bo to vplivalo na življenjsko dobo sijalke.
Opazovanje slike s fluorescenčnim mikroskopom:
(1) Približno 5-10 minut po vklopu vira fluorescentne svetlobe je intenzivnost vzbujalne svetlobe stabilna in vzorec se naloži za opazovanje; da bi preprečili dušenje fluorescence vzorca zaradi čezmerne vzbujevalne svetlobe med postopkom fokusiranja in iskanja predmetov, najprej pomanjšajte fluorescenčni mikroskop. Nastavite vzbujevalno svetlobo na zmerno jakost z zaslonko zaslonke ali dodajte filter ND in redno premikajte oder za vzorce. Ko potrdite zrcalno sliko, prilagodite fluorescentno stanje za fotografiranje in snemanje.
(2) Prilagoditve za slabo kakovost slike. Poleg faktorjev priprave vzorca so potrebne prilagoditve, ki jih je mogoče izvesti, naslednje:
① Izključite naprave za zaščito pred svetlobo ali naprave za omejevanje svetlobe v optični poti slikanja, kot so dodatki DIC, filtri ND itd.
②Znova prilagodite ostrenje sprejemnika in velikost diafragme zaslonke fluorescenčnega mikroskopa.
③ Previdno prilagodite obroč za korekcijo razlike v pokritosti objektiva fluorescenčnega mikroskopa.
Točke uporabe fluorescenčne mikroskopije
Fluorescenčna mikroskopija uporablja "aktinično fluorescenčno" slikanje. Če je izbrana valovna dolžina vzbujanja v skoraj ultravijoličnem območju (320-400nm), ki je s prostim očesom nevidno, je tudi emisijski spekter fluorescence krajši od povprečne valovne dolžine navadnih svetlobnih zrcalnih svetlobnih virov. izboljšati. Visokoenergijski fotoni trčijo z elektroni, kar povzroči prehod elektronov iz osnovnega stanja v vzbujeno stanje. Elektroni v vzbujenem stanju so zelo nestabilni in bodo padli nazaj v osnovno stanje. Pri tem procesu se bo del toplotne energije porabil in oddali bodo novi fotoni. Novi foton ima nižjo energijo od prvotnega fotona in ima zato daljšo valovno dolžino. Ker je valovna dolžina novega fotona drugačna od valovne dolžine fotona vpadne svetlobe, sta svetlobna snopa z različnimi valovnimi dolžinami ločena z določeno metodo optične obdelave, tako da vidimo samo oddane nove fotone (fluorescenčni signal), tj. fluorescenčni mikroskop vidi fluorescenčne slike.
