Obstajata dve vrsti fluorescenčnih mikroskopov glede na njihovo optično pot
1. Transmisijski fluorescenčni mikroskop: vir vzbujanja svetlobe gre skozi material vzorca skozi zbiralno lečo, da vzbudi fluorescenco. Običajno se uporablja zbiralnik temnega polja, navaden zbiralnik pa se lahko uporablja tudi za nastavitev zrcala, tako da se vzbujevalna svetloba preusmeri in zaobide vzorcu. To je starejši fluorescentni mikroskop. Prednost je, da je fluorescenca močna pri majhni povečavi, slabost pa je, da se fluorescenca z večanjem povečave zmanjšuje. Zato je bolje opazovati materiale večjih vzorcev.
2. Epi-fluorescenčni mikroskop je nova vrsta fluorescenčnega mikroskopa, razvita v sodobnem času. Razlika je v tem, da vzbujevalna svetloba pada od leče objektiva navzdol na površino vzorca, to pomeni, da se ista leča objektiva uporablja kot osvetljevalni kondenzor in leča objektiva za zbiranje fluorescence. Na pot svetlobe je treba dodati dihroični razdelilnik žarka, ki je 45 stopinj stran od lahkega urana. Vzbujevalna svetloba se odbije v lečo objektiva in zbere na vzorcu. Fluorescenca, ki jo ustvari vzorec, in vzbujevalna svetloba, ki jo odbijeta površina leče leče objektiva in površina pokrovnega stekla, istočasno vstopita v lečo objektiva in se vrneta v dvobarvni razdelilnik žarka, da se vzbujevalna svetloba loči od fluorescence. , preostalo vzbujevalno svetlobo absorbirajo blokirni filtri. Kot na primer prehod na kombinacijo različnih vzbujevalnih filtrov/dvobarvnega razdelilnika žarkov/blokirnega filtra, lahko zadovolji potrebe različnih fluorescentnih reakcijskih produktov. Prednost tovrstnega fluorescenčnega mikroskopa je, da je osvetlitev vidnega polja enakomerna, slika jasna in večja kot je povečava, močnejša je fluorescenca.
