Tehnike barvanja in mikroskopsko opazovanje mikroorganizmov
1. Namen
1.1 Naučite se osnovnih tehnik mikrobnih brisov in barvanja.
1.2 Obvladajte preprosto metodo barvanja bakterij.
1.3 Predhodno razumeti morfološke značilnosti bakterij in utrditi znanje o uporabi oljnih leč in tehnikah aseptičnega delovanja.
2 Načela
Razmazovanje in obarvanje bakterij je osnovna tehnika v mikrobioloških poskusih. Bakterijske celice so majhne in prozorne, zato jih je težko prepoznati pod navadnim svetlobnim mikroskopom; morajo biti obarvani. Za barvanje bakterij se uporablja eno samo barvilo, tako da obarvane bakterije tvorijo jasno barvno razliko od ozadja, tako da je mogoče bolj jasno opazovati njihovo morfologijo in strukturo. Ta metoda je enostavna za uporabo in primerna za opazovanje splošne oblike bakterijskih celic in razporeditve bakterij. Osnovna barvila se običajno uporabljajo za preprosto barvanje. To je zato, ker so v nevtralnih, alkalnih ali šibko kislih raztopinah bakterijske celice običajno negativno nabite, pri ionizaciji bazičnih barvil pa je barvilni del njihovih molekul pozitivno nabit, zato so alkalne. Barvni del barvila se zlahka poveže z bakterijami, da jih obarva. Obarvane bakterijske celice so v ostrem kontrastu z ozadjem, zaradi česar jih je lažje prepoznati pod mikroskopom. Barvila, ki se običajno uporabljajo za preprosto barvanje, vključujejo metilensko modro, kristalno vijolično, bazični fuksin itd. Ko bakterije razgradijo sladkorje in proizvedejo kislino, kar povzroči padec pH gojišča, se pozitivni naboj na bakterijah poveča. V tem času se lahko za barvanje uporabljajo kisla barvila, kot so eozin, kisli fuksin ali kongo rdeča. Pred barvanjem je treba bakterije fiksirati. Ima dva namena: prvi je uničiti bakterije in jih prisiliti, da se oprimejo stekelca; drugi je povečati njihovo afiniteto za barvila. Dve pogosto uporabljeni metodi sta segrevanje in kemična fiksacija. Pri fiksiranju poskušajte ohraniti prvotno obliko celic.
3 materiali
3.1 Bakterije: Bacillus subtilis 12-18h hranilna poševna kultura na agarju, Staphylococcus aureus 24-urna hranilna poševna kultura na agarju, Escherichia coli 24-urna hranilna poševna kultura na agarju, pekovski kvas poševna kultura na agarju.
3.2 Sredstvo za barvanje: Lujevo alkalno metilensko modro barvilo (ali kristalno vijolično barvilo amonijevega oksalata), barvilo fuksin karbolne kisline.
3.3 Instrumenti ali drugi pripomočki: mikroskop, alkoholna svetilka, predmetno stekelce, inokulacijska zanka, stojalo za predmetna stekla, dvoslojna steklenica (ki vsebuje cedrovo olje in ksilen), robček za leče, fiziološka raztopina ali destilirana voda itd.
4. Postopek: razmaz → sušenje → fiksacija → barvanje → pranje → sušenje → mikroskopski pregled.
5 korakov
5.1 Bris: Vzemite dve čisti in oljni stekelci. V sterilnih pogojih kanite majhno kapljico fiziološke raztopine (ali destilirane vode) na vsako sredino stekelca. Za sterilizacijo bakterij Bacillus subtilis uporabite inokulacijsko zanko. , Micrococcus luteus in Escherichia coli, v vodne kapljice poševno poberite malo bakterijske trate, dobro premešajte in nanesite v tanek film. Če uporabljate razmaz bakterijske suspenzije (ali tekoče kulture), lahko uporabite inokulacijsko zanko, da izberete 2 do 3 zanke in jih nanesete neposredno na stekelce. Pazimo, da ne kapnemo preveč fiziološke raztopine (destilirane vode) in odstranimo bakterije ter nanesemo enakomerno in ne pregosto.
5.2 Sušenje Sušite naravno pri sobni temperaturi. Lahko ga tudi rahlo segrejete nad alkoholno lučko s premazano stranjo navzgor, da se posuši. Pazite, da se ne približate ognju, saj bo previsoka temperatura uničila morfologijo bakterij.
5.3 Fiksacija Če se uporablja sušenje z ogrevanjem, sta fiksacija in sušenje združena v en korak, metoda pa je enaka sušenju. Razmažite, posušite in toplotno fiksirajte.
5.4 Barvanje: Predmetno stekelce položite ravno na stojalo za objektna stekelca in na razmaz dodajte 1 do 2 kapljici raztopine barvila (primerno je, da raztopina barvila samo prekrije film razmaza). Barvajte z lujevim bazičnim metilensko modrim 1 do 2 minuti in približno 1 minuto barvajte s fuksinom karbolne kisline (ali kristalno vijoličnim amonijevim oksalatom).
5.5 Pranje z vodo: Odlijte raztopino barvila in nežno izpirajte z vodo iz pipe z enega konca stekelca, dokler voda, ki teče z razmaza, ni brezbarvna. Pri umivanju z vodo premazane površine ne umivajte neposredno z vodo. Pretok vode ne sme biti prehiter ali prevelik, da preprečite odpadanje madežev.
5.6 Sušenje: Otresite vodne kapljice na objektnem stekelcu in posušite naravno, posušite s sušilcem za lase ali popivnajte z vpojnim papirjem (pazite, da ne obrišete bakterij). 5.7 Mikroskopski pregled Ko se bris posuši, opravite mikroskopski pregled. Pred ogledom z oljno lečo mora biti razmaz popolnoma suh.
6 Rezultati Narišite morfologijo E. coli in Micrococcus luteus, opaženo po enkratnem barvanju.
