Metode za povečanje goriščne globine večfotonskih mikroskopov
Kombinacija dvo-fotonskega laserskega vrstičnega mikroskopa in kalcijevega indikatorja je zlati standard za zaznavanje nevronskih signalov in vivo. Nevroni v nevronskih mrežah so razporejeni v tri-dimenzionalnem prostoru in spremljanje njihove dinamike aktivnosti zahteva način za hitro izboljšanje stopnje volumskega slikanja. Vendar pa bo uporaba večfotonskega mikroskopa z rešetkastim skeniranjem za slikanje velikega števila slik, če se za doseganje višje stranske ločljivosti uporabi objektiv z visoko numerično aperturo (NA), to povzroči manjšo žariščno globino. Da bi dobili prostorninsko sliko pri majhni žariščni globini,
Potrebno je izvesti skeniranje osi Z- na nek način, slikanje številnih ravnin s skeniranjem vsake goriščne ravnine, kar močno omejuje hitrost slikanja. Če je mogoče žrtvovati informacije o aksialni sliki in je mogoče skeniranje volumna doseči v enem stranskem skeniranju z razširitvijo globine fokusa, to je, če se informacije o volumnu projicirajo na eno samo 2D sliko, se lahko hitrost slikanja močno izboljša. To se imenuje slikanje z razširjeno globino fokusa (EDF), ki je še posebej uporabno za slikanje redkih populacijskih struktur, ki zahtevajo visoko časovno ločljivost, kot je funkcionalno slikanje nevronske aktivnosti.
Aksialna in stranska ločljivost mikroskopa sta določeni z numerično odprtino (NA) leče objektiva. Visok NA lahko poveča aksialno in bočno ločljivost ter količino zbrane svetlobe; Nižja NA bo povzročila nižjo aksialno ločljivost, tj. daljšo globino fokusa, hkrati pa bo žrtvovala bočno ločljivost in učinkovitost zbiranja svetlobe. Metoda razširitve globine ostrenja, ki bo predstavljena v nadaljevanju, lahko to doseže ob ohranjanju visoke stranske ločljivosti in zadostnega svetlobnega toka.
Uporaba prostorskih svetlobnih modulatorjev za ustvarjanje žariščnih vitkih Besselovih žarkov lahko doseže slikanje EDF, vendar so prostorski svetlobni modulatorji zajetni in jih je težko združljivi z ozkimi mikroskopskimi prostori; Nasprotno pa so Besselovi moduli, ki temeljijo na aksialnih piramidah, poceni in kompaktni, vendar lahko ustvarijo le žariščne točke fiksne globine in niso primerni za različne poskuse, ki zahtevajo stalno spreminjanje žariščne globine. Da bi rešili to težavo, so leta 2018 RONGWEN LU et al. je pokazal Besselov modul, ki temelji na aksikonu, pri katerem je treba samo eno lečo prevesti vzdolž optične osi, da se nenehno prilagaja osna dolžina Besselove žariščne točke.
Slika 1 (a) Diagram naprave modula Bessela; (b) Funkcija širjenja točk je bila eksperimentalno izmerjena, ko je bil D -12 mm, 0 mm oziroma 12 mm; (c) Razmerje med stransko polno širino na polovici maksimuma, (d) aksialno polno širino na polovici maksimuma, (e) najvišjim signalom in (f) optično močjo za lečo objektiva s premikom L2 D
Naprava modula za oblikovanje Besselove žariščne točke spremenljive dolžine je prikazana na sliki 1a. Vpadni Gaussov žarek se po prehodu skozi aksikon in lečo L1 oblikuje v krožni žarek. Naslednja maska s krožno zaslonko lahko blokira razpršeno svetlobo, ki jo povzročijo napake aksikona, in tako oblikuje aksialno porazdelitev funkcije širjenja dvo-točkov vzbujanja fotonov. Nato se svetlobni žarek z lečama L2 in L3 projicira na galvanometer, nato pa skozi leči L4 in L5 doseže zadnjo goriščno ravnino leče objektiva.
Te zasnove so podobne tradicionalnim piramidnim modulom, z razliko, da je mogoče osno dolžino Besselovega žarišča nenehno prilagajati s premikanjem L2 ali L3 vzdolž optične osi. Slika 1b prikazuje funkcije širjenja osne točke za vrednosti D -12 mm, 0 mm in 12 mm, z aksialno polno širino na polovici največ 39? m, 24? M in 14? m. Kot je prikazano na sliki 1c-f, lahko premikanje leče L2 od leve proti desni neprekinjeno spreminja polno širino na polovici maksimuma v prečni in aksialni smeri, kar pomeni, da se lahko globina fokusa nenehno spreminja. Rezultati numerične simulacije, ki temeljijo na teoriji vektorske difrakcije, se dobro ujemajo z eksperimentalnimi podatki. Slika 2 preverja učinek korekcije različnih velikosti obročastih mask na napake aksikona. Ugotovljeno je bilo, da lahko tanjše obročaste maske bolje optimizirajo aksialno porazdelitev intenzitete izhodnega Besselovega žarka, hkrati pa vodijo tudi do večje izgube moči.
