Uvod v fluorescenčno mikroskopijo
Fluorescenčna mikroskopija je obsevanje predmeta, obarvanega s fluoresceinom, s svetlobo kratke valovne dolžine, tako da se vzbudi, da proizvede dolgovalovno fluorescenco, in nato opazovan. V fluorescenčnem mikroskopu je treba za ustvarjanje fluorescence izbrati vzbujevalno svetlobo določene valovne dolžine izmed osvetljevalne svetlobe vzorca, nato pa je treba fluorescenco ločiti od mešane svetlobe vzbujevalne svetlobe in fluorescence za opazovanje. Zato ima filtrirni sistem izjemno pomembno vlogo pri izbiri določene valovne dolžine. Fluorescenčni mikroskopi se pogosto uporabljajo v biologiji, medicini in na drugih področjih.
1. Glavne komponente fluorescenčnega mikroskopa:
(A) Vir svetlobe: Vir svetlobe seva svetlobo različnih valovnih dolžin (od ultravijolične do infrardeče). the
(B) Vzbujevalni vir svetlobe s filtrom: skozi svetlobo določene valovne dolžine, ki lahko povzroči, da vzorec proizvede fluorescenco, medtem ko blokira svetlobo, ki je neuporabna za vzbujanje fluorescence. the
(C) Fluorescentni primerki: običajno obarvani s fluorescenčnimi pigmenti. the
(D) Filter za blokiranje: blokira vzbujevalno svetlobo, ki je vzorec ne absorbira, in selektivno prenaša fluorescenco, nekatere valovne dolžine pa se selektivno prenašajo pri fluorescenci.
the
2. Razvrstitev fluorescenčnih mikroskopov:
Fluorescenčne mikroskope na splošno delimo na dve vrsti: transmisijske in epiemisijske:
a. Vrsta prenosa: vzbujevalna svetloba prihaja z dna predmeta, ki ga je treba pregledati, kondenzator pa je kondenzator temnega polja, tako da vzbujevalna svetloba ne vstopi v objektivno lečo, fluorescenca pa vstopi v objektivno lečo. Pri majhnih povečavah je svetel, pri večjih pa temen. Težko je delovati pri potopitvi v olje in centriranju. Še posebej težko je določiti obseg osvetlitve pri majhnih povečavah, vendar lahko dobite zelo temno ozadje vidnega polja. Vrsta prenosa se ne uporablja za neprozorne predmete. the
b. Tip Epi: Tip prenosa je trenutno skoraj odpravljen. Večina novih fluorescenčnih mikroskopov je epi tipa. Vir svetlobe prihaja od zgoraj pregledanega predmeta, na optični poti pa je razdelilnik žarka, zato je primeren tako za prozorne kot neprozorne predmete, ki jih pregledujemo. Ker leča objektiva deluje kot zbiralna leča, ni le enostavna za uporabo, temveč lahko doseže tudi enakomerno osvetlitev celotnega vidnega polja od majhne povečave do velike povečave. the
the
3. Varnostni ukrepi za fluoroskopijo
a. Dolgotrajno obsevanje vzbujevalne svetlobe bo povzročilo oslabitev in dušenje fluorescence, zato čim bolj skrajšajte čas opazovanja in uporabite loputo, da zakrijete vzbujevalno svetlobo, ko začasno ne opazujete. the
b. Pri opazovanju z oljno imerzijsko lečo uporabite "nefluorescentno olje". the
c. Fluorescenca je skoraj vedno šibka in jo je treba izvajati v temnem prostoru. the
d. Najbolje je, da v napajalnik namestite stabilizator napetosti, sicer nestabilna napetost ne bo samo skrajšala življenjske dobe živosrebrne žarnice, temveč bo vplivala tudi na učinek pregleda mikroskopa. the
the
4. Uporaba fluorescenčne mikroskopije
1. Zahteve za pripravo vzorcev fluorescenčnega mikroskopa
a. Steklenica
Debelina stekelca mora biti med 0,8 in 1,2 mm. Predebelo stekelce bo po eni strani absorbiralo več svetlobe, po drugi strani pa vzbujevalne svetlobe ni mogoče koncentrirati na preparatu. Stekelca morajo biti gladka, enakomerne debeline in brez očitne avtofluorescence. Včasih se uporabljajo stekelca iz kremenčevega stekla. the
b. Pokrivno steklo
Debelina pokrovnega stekla je približno 0,17 mm, gladko. Za okrepitev vzbujalne svetlobe se lahko uporablja tudi suho pokrivno steklo, to je posebno pokrivno steklo, prevlečeno z več plastmi snovi (kot je magnezijev fluorid), ki imajo različne interferenčne učinke na svetlobo različnih valovnih dolžin, zaradi česar lahko fluorescenca poteka gladko. Skozi gre vzbujevalna svetloba, odbita vzbujevalna svetloba pa vzbuja vzorec. the
c. Primerek
Rezine tkiva ali drugi vzorci ne smejo biti predebeli. Če je predebela, bo večina vzbujalne svetlobe porabljena v spodnjem delu preparata, medtem ko zgornjega dela, ki ga neposredno opazuje leča objektiva, ni mogoče v celoti vzbujati. Poleg tega pride do prekrivanja celic ali nečistoč, kar vpliva na presojo. the
d. Montažno sredstvo
Glicerin se običajno uporablja kot pritrdilno sredstvo, ki ne sme imeti avtofluorescence, brezbarvno in prozorno, svetlost fluorescence pa je svetlejša pri pH 8.5-9.5, in ni lahko hitro zbledeti. Zato se kot pritrdilno sredstvo običajno uporablja enaka mešanica glicerola in 0.5mol/L raztopine karbonatnega pufra s pH od 90 do 9,5. the
e. olje za ogledalo
Na splošno je treba pri opazovanju vzorcev s fluorescenčnimi mikroskopi s temnim poljem in oljnimi imerzijskimi imerzijskimi objektivi uporabljati imerzijsko olje. Najbolje je uporabiti posebno nefluorescentno olje za ogledala, ki ga lahko nadomestimo tudi z zgoraj omenjenim glicerinom, lahko pa tudi tekoči parafin, vendar je lomni količnik nizek, kar nekoliko vpliva na kakovost slike.
