Kako opazujemo morfologijo mikrobnih celic pod mikroskopom?
Mikroskopi so bili izumljeni za opazovanje nasmejanih predmetov, ki jih ni mogoče videti s prostim očesom. Mikroorganizmi so zelo majhni, zato jih moramo povečati in opazovati s pomočjo mikroskopa. Poleg tega obstaja veliko vrst mikroorganizmov, tako da lahko večina optičnih mikroskopov opazuje mikroorganizme. Naslednje vprašanje je, kakšen tip mikroskopa uporabiti za opazovanje in analizo kakšnih mikroorganizmov. Običajni mikroskopi, ki se lahko uporabljajo za opazovanje mikrobne morfologije, vključujejo biološke mikroskope, fazno kontrastne mikroskope, invertne mikroskope, fluorescenčne mikroskope, konfokalne mikroskope itd.
V nadaljevanju so opisani različni mikroskopi, ki se uporabljajo za opazovanje mikroorganizmov:
1. Navadni optični mikroskop kot vir svetlobe uporablja naravno svetlobo ali svetlobo, njegova valovna dolžina pa je približno 0,4 μm. Ločljivost mikroskopa je polovica valovne dolžine, to je 0,2 μm, najmanjša s prostim očesom vidna slika pa je 0,2 mm. Zato lahko z uporabo oljnega (potopnega) ogledala za 1000-kratno povečavo delce velikosti 0,2 μm povečate na 0,2 mm, vidne s prostim očesom. Za opazovanje bakterij, aktinomicet in gliv se lahko uporabljajo navadni optični mikroskopi.
2. Mikroskopija s temnim poljem se običajno uporablja za opazovanje neobarvane mikrobne morfologije in gibanja. Ko je kondenzor temnega polja nameščen v običajnem mikroskopu, svetloba ne more prodreti neposredno iz sredine in vidno polje je temno. Ko vzorec prejme poševno svetlobo z roba kondenzorja, se lahko razprši, tako da lahko na ozadju temnega polja opazujemo svetle mikroorganizme, kot so bakterije ali spirohete.
3. Fazno kontrastni mikroskop Fazno kontrastni mikroskop uporablja svetlobni učinek plošče fazne razlike, da spremeni svetlobno fazo in amplitudo neposredne svetlobe ter pretvori razliko svetlobne faze v razliko svetlobne jakosti. Pod fazno-kontrastnim mikroskopom, ko svetloba prehaja skozi neobarvan preparat, je razlika v svetlobni fazi posledica neskladnosti gostote različnih delov preparata, pri čemer je mogoče opazovati morfologijo, notranjo strukturo in način gibanja mikroorganizmov.
4. Fluorescenčni mikroskop Fluorescenčni mikroskop je v bistvu enak navadnemu optičnemu mikroskopu, glavna razlika je vir svetlobe, filter in kondenzator. Trenutno jih večina uporablja epi-light naprave, kot vir svetlobe pa se običajno uporabljajo visokotlačne živosrebrne sijalke, ki lahko oddajajo ultravijolično ali modro-vijolično svetlobo. Obstajata dve vrsti filtrov: vzbujevalni filter in absorpcijski filter. Poleg splošnih kondenzatorjev svetlega polja se lahko v fluorescenčnih mikroskopih uporabljajo tudi kondenzatorji temnega polja, ki uporabljajo modro svetlobo za izboljšanje kontrasta med fluorescenco in ozadjem. Ta metoda je uporabna za odkrivanje ali identifikacijo bakterij, obarvanih s fluorescentnimi pigmenti ali v kombinaciji s fluorescentnimi protitelesi.
5. Elektronski mikroskopi kot vir svetlobe uporabljajo tok elektronov, valovna dolžina pa je desettisočkrat drugačna od vidne svetlobe, kar močno izboljša ločljivost. Prav tako uporablja magnetno tuljavo kot sistem optičnega ojačanja, povečava pa lahko doseže več deset tisoč ali sto tisočkrat. Pogosto se uporablja za opazovanje virusnih delcev in ultrastrukture bakterij.
Opazovanje neobarvanih mikrobnih vzorcev:
Neobarvane vzorce lahko na splošno uporabimo za opazovanje bakterijske morfologije, moči in gibanja. Bakterije so brezbarvne in prozorne, ko niso obarvane, pod mikroskopom pa jih opazimo predvsem po razliki med lomnim količnikom bakterije in okolice. Bakterije z bički se gibljejo živahno, medtem ko bakterije brez bičkov kažejo nepravilno Brownovo gibanje. Preživetje sposobne bakterije, kot so Treponema pallidum, Leptospira in Campylobacter, imajo značilne oblike in vzorce gibanja, ki so diagnostično pomembni. Običajno uporabljene metode so metoda padca tlaka, metoda visečega padca in kapilarna metoda.
1. Okoli konkavne luknje čistega konkavnega stekla nanesite vazelin z metodo viseče kapljice, uporabite inokulacijsko zanko, da vzemite obroč bakterijske suspenzije in ga postavite na sredino pokrovnega stekla, nato poravnajte konkavno luknjo konkavnega stekla z kapljico v sredino pokrovnega stekla in ga pokrijte, nato ga hitro obrnite, pokrovno steklo rahlo pritisnite, da se tesno oprime vazelina na robu konkavne luknje, in opazujte pod mikroskopom z veliko povečavo (oz. temno polje).
2. Vzemite obroček bakterijske suspenzije z inokulacijsko zanko in ga postavite na sredino čistega steklenega stekelca z metodo padca tlaka ter nežno pokrijte bakterijsko suspenzijo s pokrovnim steklom, pri čemer pazite, da se izognete mehurčkom in prelivanju bakterijske suspenzije. . Po nekaj sekundnem mirovanju opazujte pod visokozmogljivim mikroskopom v svetlem (ali temnem) polju.
3. Kapilarna metoda se uporablja predvsem za preiskavo kinetike anaerobnih bakterij. Običajno izberite dolžino 60~70mm. Po sifoniranju suspenzije anaerobnih bakterij skozi kapilaro z odprtino 0.5-1.0 mm zaprite oba konca kapilare s plamenom. Kapilara je bila fiksirana na stekelcu s plastičnim papirjem in opazovana pod svetlobno lečo v temnem polju.
Opazovanje obarvanih mikrobnih vzorcev z mikroskopom:
Ko je bakterijski vzorec obarvan, se zaradi ostrega barvnega kontrasta med bakterijo in okoliškim okoljem spremenijo morfološke značilnosti bakterij (kot so velikost, oblika, razporeditev itd.) bakterij in nekatere posebne strukture (npr. kot kapsule, bički, spore itd.) je mogoče jasno opazovati pod navadnim optičnim mikroskopom, bakterije pa je mogoče razvrstiti in identificirati glede na reaktivnost obarvanja.
(1) Splošni postopek bakterijskega barvanja Splošni postopek bakterijskega barvanja je: bris (sušenje)—fiksacija—barvanje.
1. Priprava brisov krvi, izločkov, izločkov, punkcijske tekočine in tekoče kulture ter neposredni tanki filmski brisi na stekelcih; obdukcije ali okuženih živalskih tkiv, namažite lezijo z vatirano palčko za vzorčenje. Za pripravo bakterijskih kolonij ali trate na trdnem gojišču najprej uporabite inokulacijsko zanko, da vzemite obroček fiziološke raztopine in ga postavite na sredino stekelca, nato pa s sterilno inokulacijsko zanko vzemite majhno količino kulture in jo zdrobite. enakomerno razporedite v fiziološko raztopino, razporedite na 1 cm2 premazane površine in pustite, da se naravno posuši pri sobni temperaturi ali počasi sušite na daljavo.
2. Namen fiksacije je ubiti bakterije, koagulirati bakterijske beljakovine in strukturo ter olajšati obarvanje; spodbujanje bakterij, da se oprimejo predmetnega stekelca, da jih med pranjem ne spere voda; spremenijo prepustnost bakterij za barvila, kar je koristno za obarvanje znotrajceličnih struktur bakterij. Običajno ga fiksiramo s segrevanjem s plamenom, posušen zmazek pa na hitro 3x prevlečemo skozi plamen. Bolje je, da ne opečete kože na zadnji strani roke, ko se dotaknete stekelca.
3. Barvanje Glede na različne inšpekcijske namene izberite različne metode barvanja za barvanje. Pri barvanju dodajte raztopino barvila po kapljicah, da povečate prekrivnost.
4. Jedkalo Vsako snov, ki lahko poveča afiniteto med barvilom in barvanim predmetom, fiksira barvilo na barvanem predmetu in povzroči spremembo prepustnosti celične membrane, imenujemo jedkalo. Običajno se uporabljajo galun, taninska kislina, kovinske soli in jod itd., segrevanje pa se uporablja tudi za spodbujanje barvanja. Sredstva za obarvanje se lahko uporabljajo med primarnim obarvanjem in nasprotnim obarvanjem, lahko pa se uporabljajo tudi po fiksaciji ali pa so vsebovana v fiksativu in obarvanju.
5. Razbarvanje Vsako kemično sredstvo, ki lahko odstrani barvo barvanega predmeta, se imenuje sredstvo za razbarvanje. Kot sredstva za razbarvanje se običajno uporabljajo etanol, aceton itd. Sredstvo za razbarvanje lahko zazna stopnjo stabilnosti kombinacije bakterij in barvil, kar se lahko uporabi za diferencialno barvanje.
6. Kontrabarvanje Bakterije ali njihove strukture, ki so bile razbarvane, so pogosto kontrastno obarvane z raztopino protibarvanja za lažje opazovanje. Barva raztopine za nasprotno barvanje je drugačna od barve raztopine za primarno barvanje, da tvori oster kontrast. Kontrabarvanje naj ne bo premočno, da ne prekrije barve začetnega barvanja.
