Kako lahko izberete pravi konfokalni mikroskop zase? Ali obstaja kakšna posebna metoda?
Konfokalna mikroskopija ima več prednosti kot mikroskopija s širokim poljem. Konfokalna mikroskopija lahko izvede neprekinjeno optično sečenje vzorcev in izključi motnje signala iz nefokalnih ravnin. Zaradi tega je uporaba konfokalne mikroskopije res pogostejša. Je pa na trgu vedno več konfokalnih mikroskopov. Kako izbrati?
Konfokalna mikroskopija ima več prednosti kot mikroskopija s širokim poljem. Konfokalna mikroskopija lahko naredi neprekinjene optične reze vzorcev in izključi motnje signala iz nefokalnih ravnin. Zaradi tega je konfokalna mikroskopija res pogostejša. Je pa na trgu vedno več konfokalnih mikroskopov. Kako izbrati? Pri izbiri konfokalnega mikroskopa obstajata dva osnovna in pomembna vidika: vrsta vzorca, ki ga želite preučevati (npr. fiksne ali žive celice), in vrsta testa, ki ga želite izvesti (npr. statični ali dinamični celični procesi).
Konfokalno slikanje fiksnih celic
Za slikanje fiksiranih in obarvanih celic ali tkiv običajno izberemo konfokalno lasersko skeniranje (LSCM). To je predvsem zato, ker fiksne mrtve celice nimajo hitrih bioloških dogodkov v živih celicah in lahko bolje izkoristijo višjo prostorsko ločljivost LSCM. Slikanje LSCM je optično rezanje vzorca z laserjem, hitrost skeniranja (odvisno od hitrosti zrcala niza skeniranja) pa je na splošno 1 sličica na sekundo. Daljši čas osvetlitve pomeni večje tveganje fotobeljenja, vendar za fiksirane odmrle celice čas ni kritičen in ga lahko izračunamo v povprečju z večkratnim fotografiranjem.
Konfokalno slikanje živih celic
Slikanje živih celic zahteva dodatno zaščito pred neprijaznimi okolji. Pri slikanju je naša prva skrb ohranjanje sposobnosti preživetja in zdravja celic. Grelni elementi s konstantno temperaturo in perfuzijski sistemi so bistveni, zlasti za študije časovnega zamika. Hitri biokemični dogodki, ki nadzorujejo fiziološko stanje živih celic, so tisto, kar večina ljudi želi preučevati, vendar so ti dogodki prehitri za običajni LSCM. Poleg tega je dolgotrajna izpostavljenost LSCM povzročila tudi poškodbe celic s toksično svetlobo. Zato slikanje živih celic zahteva posebne konfokalne mikroskope.
Na splošno obstajata dve možnosti za konfokalno slikanje živih celic: konfokali s hitrim laserskim skeniranjem in konfokali z vrtljivim diskom. Konfokalna mikroskopija s hitrim skeniranjem nadomešča počasnejša zrcala galvanometrov s hitrejšimi resonančnimi zrcali za skeniranje, kar omogoča hitrosti skeniranja do 30 sličic na sekundo; medtem ko imajo konfokali vrtečih se diskov (SDCM) prednost hitrejšega skeniranja (čeprav neizogibno z izgubo prostorske ločljivosti), lahko njihova hitrost teoretično doseže 2000 sličic na sekundo (v praksi je pogosto omejena z drugimi dejavniki).
Če vas skrbi fotobeljenje ali zelo šibek fluorescenčni signal, je SDCM morda bolj primeren. SDCM uporablja dva vrteča se diska z razporejenimi mikrovdolbinami za razpršitev vzbujalne svetlobe. Za razliko od LSCM, ki skenira mesto vzorca, SDCM pridobi več točk hkrati (približno 100 slikovnih pik), zato se hitrost močno poveča, fotobeljenje SDCM in manjša fototoksičnost. Vendar pa lahko uporabite tudi konfokale s hitrim skeniranjem, da povečate hitrost skeniranja v kombinaciji z visoko občutljivimi detektorji in zmanjšate energijo vzbujanja svetlobe, da zmanjšate fototoksičnost, kar lahko ohrani bogate funkcije tradicionalnih konfokalov.
Avtomatski sistem za konfokalno slikanje
Nekateri raziskovalci radi iščejo načine za prilagoditev mikroskopa, da ustreza njihovim individualnim potrebam. Nekaterih raziskovalcev sploh ne zanima, kako mikroskopi dejansko delujejo. Slednjim bo morda bolj po godu avtomatski konfokalni mikroskop. Na primer, Olympus FluoViewFV10i je tak popolnoma avtomatski namizni 4-laserski konfokalni mikroskop. Njegova kompaktna integrirana struktura ne zahteva skoraj nič prostora za namestitev. Ta vrsta instrumentov je idealna za raziskovalce, ki morajo vsak dan opraviti veliko pridobivanja slikovnih podatkov, vendar seveda ne odražajo v celoti funkcionalnosti in prilagodljivosti tradicionalnih konfokalov. Poleg tega je NikonA1 tudi popolnoma samodejni konfokalni sistem. Kot večina običajnih konfokalnih skenirnih mikroskopov uporablja tudi NikonA1 galvanometrsko skenirno glavo, ki ima višjo ločljivost kot A1R s hibridno skenirno glavo, vendar nekoliko počasnejšo hitrost (A1R ~30fps).
