Izboljšanje prednosti večfotonske mikroskopije z laserskim skeniranjem
Večfotonska mikroskopija z laserskim skeniranjem je velik napredek v primerjavi z optično mikroskopijo. Opazuje lahko globoko strukturo živih celic, fiksnih celic in tkiv ter lahko pridobi jasne in ostre večplastne strukture ravnine Z, to je optične reze, iz katerih lahko sestavi tridimenzionalno trdno strukturo vzorca. Konfokalna mikroskopija uporablja vir laserske svetlobe, ki po ekspanziji zapolni celotno zadnjo goriščno ravnino leče objektiva, nato pa gre skozi sistem leč objektivne leče, da se konvergira v zelo majhno točko na goriščni ravnini vzorca. Odvisno od numerične zaslonke leče objektiva je premer najsvetlejše svetlobne točke približno 0.25 ~ 0.8 μm, globina pa približno 0.5 ~ 1.5 μm . Velikost konfokalne točke je odvisna od zasnove mikroskopa, valovne dolžine laserja, značilnosti leče objektiva, nastavitev stanja enote za skeniranje in lastnosti vzorca. Terenska mikroskopija ima velik razpon in globino osvetlitve, medtem ko ima konfokalna mikroskopija usmerjeno osvetlitev, osredotočeno na žariščno točko na goriščni ravnini. Najosnovnejša prednost konfokalne mikroskopije je, da lahko izvede fino optično rezanje debelih fluorescenčnih vzorcev (ki lahko dosežejo 50 μm ali več), debelina rezov pa je približno 0,5 do 1,5 μm. Serijo slik optičnega preseka lahko dobite s premikanjem vzorca navzgor in navzdol z uporabo koračnega motorja mikroskopa na osi Z. Pridobivanje informacij o sliki je nadzorovano znotraj ravnine in ga ne bodo motili signali, oddani z drugih lokacij na vzorcu. Po odstranitvi vpliva fluorescence ozadja in povečanju razmerja med signalom in šumom sta kontrast in ločljivost konfokalnih slik znatno izboljšana v primerjavi s tradicionalnimi fluorescenčnimi slikami, osvetljenimi s poljem. V mnogih vzorcih je veliko zapletenih strukturnih komponent prepletenih, da tvorijo zapletene sisteme, toda ko je mogoče zbrati dovolj optičnih odsekov, jih lahko s programsko opremo rekonstruiramo v treh dimenzijah. Ta eksperimentalna metoda se pogosto uporablja v bioloških raziskavah za pojasnitev kompleksnih strukturnih in funkcionalnih odnosov med celicami ali tkivi.
