Direktno štetje mikroorganizmov z mikroskopom
Eksperimentalni princip
Neposredno štetje pod mikroskopom z uporabo hemocitometra je pogosto uporabljena metoda štetja mikrobov. Prednost te metode je, da je intuitivna in hitra. Ustrezno razredčeno bakterijsko suspenzijo (ali suspenzijo spor) postavite v števno komoro med objektno stekelce in pokrovno steklo hemocitometra ter preštejte pod mikroskopom. Ker je prostornina štetne komore fiksna (0,1 mm2), jo je mogoče pretvoriti v skupno število mikroorganizmov na enoto prostornine glede na število mikroorganizmov, opazovanih pod mikroskopom. Ker ta metoda šteje vsoto živih in mrtvih bakterij, se imenuje tudi metoda štetja skupnih bakterij.
Hemocitometer je običajno posebno stekelce, na katerem štirje utori tvorijo tri ploščadi. Ploščad v sredini je razdeljena na dve polovici s kratkim vodoravnim utorom. Na vsaki strani ploščadi je vgravirana mreža. Vsaka mreža je razdeljena na devet velikih kvadratov. Velik kvadrat na sredini je soba za štetje. Mikroorganizme preštejemo v štetni komori. Struktura plošče za štetje krvnih celic je prikazana na sliki Ⅷ-1.
Lestvica sobe za štetje ima na splošno dve specifikaciji, ena je, da je velik kvadrat razdeljen na 16 srednjih kvadratov, vsak srednji kvadrat pa je razdeljen na 25 majhnih kvadratov (slika Ⅷ-2); drugi je velik kvadrat. Kvadrat je razdeljen na 25 srednjih kvadratov, vsak srednji kvadrat pa je razdeljen na 16 majhnih kvadratov (slika Ⅷ-1, C). Toda ne glede na vrsto štetne plošče je število majhnih kvadratov v vsakem velikem kvadratu enako, to je 16×25=400 majhnih kvadratov, kot je prikazano na sliki Ⅷ-2.
Stranica vsakega velikega kvadrata je 1 mm, ploščina vsakega velikega kvadrata pa 1 mm2. Ko je pokrovno steklo pokrito, je višina med diapozitivom in pokrovnim steklom 0.1 mm, tako da je prostornina števne komore 0.1 mm3.
Pri štetju običajno preštejte skupno število bakterij v petih srednjih mrežah, nato dobite povprečno vrednost vsake srednje mreže in nato pomnožite s 16 ali 25, da dobite skupno število bakterij v veliki mreži, in nato pretvorite v skupno število bakterij v 1 ml raztopine bakterij.
Laboratorijska oprema
Hemocitometer, mikroskop, pokrovno stekelce, sterilna kapilara;
Eksperimentalni materiali
Suspenzija Saccharomyces cerevisiae
Eksperimentalni postopek (metoda neposrednega štetja z mikrobnim mikroskopom)
1. redčenje
Ustrezno razredčite suspenzijo Saccharomyces cerevisiae. Če bakterijska raztopina ni gosta, je ni treba redčiti.
2. Mikroskopska štetna soba
Preden dodate vzorce, izvedite mikroskopski pregled števne komore števne plošče. Če je umazanija, jo je treba pred štetjem očistiti.
3. dodajte vzorec
Čisto in suho hemocitometrsko ploščo pokrijte s pokrovnim steklom, nato pa s sterilno kapalko s tankimi usti kapnite majhno kapljico razredčene raztopine Saccharomyces cerevisiae z roba pokrovnega stekla (ne preveč), tako da raztopina bakterij je blizu vrzeli vzdolž vrzeli. Kapilarna osmoza vstopi v štetno komoro sama, splošno štetno komoro pa je mogoče napolniti z bakterijsko tekočino. Pazite, da ne pride do zračnih mehurčkov.
4. mikroskopsko štetje
Po 5 minutah počitka postavite hemocitometer na mizico mikroskopa, najprej uporabite lečo z nizko močjo, da poiščete lokacijo komore za štetje, nato pa za štetje preklopite na lečo z visoko močjo. Če se pred štetjem ugotovi, da je bakterijska raztopina pregosta ali preredka, je treba pred štetjem ponovno uravnati razredčitev. Na splošno redčenje vzorca zahteva približno 5-10 bakterij v vsaki celici. Vsaka štetna komora izbere bakterije v 5 srednjih mrežah (po izbiri 4 vogali in sredinske mreže) za štetje. Bakterije na mrežni črti se običajno štejejo le na zgornji in desni črti. V primeru brstenja kvasovk, ko velikost telesa popka doseže polovico matične celice, preštejte dve bakteriji. Preštejte vzorec, da izračunate vsebnost bakterij v vzorcu iz vrednosti, preštetih v obeh štetnih komorah.
5. Čiščenje hemocitometra
Po uporabi ploščico za štetje krvnih celic na pipi sperite z vodnimi curki, ne umivajte je s trdimi predmeti, po pranju pa jo posušite sami ali s sušilcem za lase. Z mikroskopskim pregledom opazujte, ali so v vsaki celici ostanki bakterij ali drugih usedlin. Če ni čist, ga je treba večkrat oprati, dokler ni čist.
