Razlike in značilnosti med fluorescenčnimi mikroskopi in navadnimi optičnimi mikroskopi
Fluorescenčni mikroskop se od običajnega optičnega mikroskopa razlikuje po tem, da ne opazuje vzorcev pod svetlobo običajnih svetlobnih virov. Namesto tega uporablja določeno valovno dolžino svetlobe (običajno ultravijolično svetlobo, modro vijolično svetlobo), da vzbudi fluorescenčne snovi v vzorcu pod mikroskopom, zaradi česar oddajajo fluorescenco. Zato vloga vira svetlobe v fluorescenčnem mikroskopu ni neposredna osvetlitev, temveč vir energije za vzbujanje fluorescentnih snovi v vzorcu. Razlog, zakaj lahko opazujemo vzorce, ni osvetlitev svetlobnega vira, temveč pojav fluorescence, ki ga kažejo fluorescentne snovi v vzorcu po absorbciji vzbujene svetlobne energije. Iz tega je razvidno, da je značilnost fluorescenčne mikroskopije predvsem v tem, da lahko njen svetlobni vir dovaja veliko količino vzbujevalne svetlobe v določenem območju valovnih dolžin, tako da lahko fluorescentne snovi v vzorcu pridobijo potrebno intenzivnost vzbujalne svetlobe. Hkrati morajo imeti fluorescenčni mikroskopi ustrezne filtrirne sisteme. Fluorescenčni mikroskop je temeljno orodje v kemiji fluorescenčnega tkiva. Sestavljen je iz glavnih komponent, kot so ultra-visokonapetostni svetlobni vir, filtrirni sistem (vključno s filtrirnimi ploščami za vzbujanje in dušenje), optični sistem in fotografski sistem. Uporablja svetlobo določene valovne dolžine za vzbujanje vzorca in oddajanje fluorescence.
1. Metode vzbujanja fluorescence: Glede na obseg valovne dolžine svetlobe obstajata dve vrsti: metoda vzbujanja UV (z ultravijolično osvetlitvijo) in metoda vzbujanja BV (z uporabo modro vijolične svetlobe). Metoda UV vzbujanja za vzbujanje uporablja bližnjo ultravijolično svetlobo, krajšo od 400 nm. Ta metoda nima vidne vzbujalne svetlobe, zato opazovana fluorescenca kaže lastno fluorescenco barvila, kar olajša razlikovanje specifične fluorescence na vzorcu od lastne fluorescence tkiva v ozadju.
2. Metoda vzbujanja BV: Vključuje vzbujanje iz ultravijolične v modro svetlobo s središčem pri 404 nm in 434 nm. Ta metoda za obsevanje vzorca uporablja modro svetlobo, zato mora izklopni-filter sistema za opazovanje fluorescence uporabljati filter, ki lahko popolnoma blokira modro svetlobo in v celoti prehaja skozi zahtevano zeleno in rumeno fluorescenco. Fluorescentni pigmenti, ki se uporabljajo za metodo fluorescenčnih protiteles. Največja absorpcijska valovna dolžina vzbujalne svetlobe in največja emisijska valovna dolžina fluorescence sta relativno blizu, zato mora filter, ki se uporablja pri metodi vzbujanja BV, uporabljati filter z ostrim rezom. Ta metoda lahko uporablja modro svetlobo kot vzbujevalno svetlobo, zato je absorpcijska učinkovitost fluorescentnih pigmentov visoka in je mogoče dobiti svetlejše slike. Pomanjkljivost je, da ni mogoče videti fluorescence pod 500 nm, medtem ko je zaradi fluorescence nad 500 nm celotna slika rumena. Pri metodi s fluorescentnimi protitelesi je specifičnost večinoma določena z barvo, ki je edinstvena za fluorescentne pigmente, zato imajo pri razpravi o subtilni specifičnosti zgoraj omenjene pomanjkljivosti metode vzbujanja BV pogosto pomemben vpliv.
