Določanje števila mikroorganizmov-Mikroskopska metoda direktnega štetja!
Rast bakterijske populacije se kaže v povečanju števila celic ali povečanju celičnega materiala. Metode za določanje števila celic vključujejo neposredno mikroskopsko štetje, štetje na ploščah, oceno motnosti s spektrofotometrom, najverjetnejše število MPN in membransko filtracijo. (membranska filtracija) itd. Metode za merjenje celičnih substanc vključujejo določanje suhe teže celice, določanje določenih celičnih komponent, kot so vsebnost dušika, vsebnost RNK in DNK ter določanje produktov metabolitov. Skratka, obstaja veliko metod za merjenje mikrobne rasti, vsaka s svojimi prednostmi in slabostmi. Metodo je treba izbrati glede na posebne zahteve dela. Ta poskus v glavnem uvaja metodo neposrednega štetja z mikroskopom, ki se običajno uporablja v proizvodnji in znanstvenoraziskovalnem delu.
1. Zahteve glede namena
1. Pojasnite princip štetja s ploščo za štetje krvnih celic.
2. Obvladati metodo štetja mikroorganizmov s pomočjo plošče za štetje krvnih celic.
2. Osnovna načela
Metoda neposrednega štetja z mikroskopom je preprosta, hitra in intuitivna metoda, pri kateri majhno količino suspenzije vzorca, ki ga testiramo, namestimo na posebno stekelce z določeno površino in prostornino (imenovano tudi bakteriometer) in jo preštejemo neposredno pod mikroskopom. Metode. Trenutno pogosto uporabljeni bakteriometri doma in v tujini vključujejo: hemocitometer, Peteroff-Hauserjev bakteriometer in Hawksleyjev bakteriometer itd. Vse jih je mogoče uporabiti za štetje kvasovk, bakterij, spor plesni in drugih suspenzij, osnovna načela pa so enaka. Zadnja dva bakterijska števca imata skupno prostornino 0.02 mm3, potem ko sta prekrita s pokrovnim steklom, razdalja med pokrovnim steklom in stekelcem pa je le 0,02 mm. Zato se lahko za opazovanje in odkrivanje manjših celic, kot so bakterije, uporablja objektiv z oljno imerzijo. štetje. Poleg uporabe teh bakteriometrov obstaja tudi metoda ocenjevanja, ki neposredno opazuje razmerje med površino brisa in površino vidnega polja pod mikroskopom. Ta metoda se običajno uporablja za bakteriološko preiskavo mleka. Prednosti mikroskopske metode neposrednega štetja so, da je intuitivna, hitra in enostavna za uporabo. Pomanjkljivost te metode pa je, da je izmerjeni rezultat običajno vsota mrtvih in živih bakterij. Trenutno obstaja nekaj metod za odpravo te pomanjkljivosti, kot je kombinacija mikrokomorne kulture, ki obarva žive bakterije (kratek čas) in dodajanje inhibitorjev celične delitve, da se doseže namen štetja samo živih bakterij.
Ta poskus uporablja hemocitometer kot primer za neposredno štetje pod mikroskopom. Za uporabo drugih dveh bakteriometrov glejte navodila vsakega proizvajalca. Neposredno štetje pod mikroskopom z uporabo hemocitometra je pogosto uporabljena metoda mikrobiološkega štetja. Števna plošča je poseben drsnik s štirimi utori, ki tvorijo tri ploščadi; širša ploščad v sredini je razdeljena na dve polovici s kratkim vodoravnim utorom, na vsaki strani ploščadi pa je mrežasta mreža. Vsaka kvadratna mreža je razdeljena na devet velikih kvadratov, velik kvadrat na sredini pa je soba za štetje. Struktura plošče za štetje krvnih celic je prikazana na sliki {{0}}. Na splošno obstajata dve specifikaciji za lestvico štetne komore. Eden je velik kvadrat, razdeljen na 25 srednjih kvadratov, vsak srednji kvadrat pa je razdeljen na 16 majhnih kvadratov (slika 15-2); drugi je velik kvadrat. Kvadratna mreža je razdeljena na 16 srednjih kvadratov, vsak srednji kvadrat pa je razdeljen na 25 majhnih kvadratov. Ne glede na to, za kakšno štetje gre, je v vsakem velikem kvadratku 400 majhnih kvadratkov. Dolžina stranice vsakega velikega kvadrata je lmm, potem je ploščina vsakega velikega kvadrata lmm2. Ko je pokrovno stekelce pokrito, je višina med pokrovnim stekelcem in stekelcem 0,lmm, tako da je prostornina števne komore 0,lmm3 (ena desettisočinka mililitra). Slika 15-1 Struktura plošče za štetje krvnih celic (1) Slika 15-2 Struktura plošče za štetje krvnih celic (2) A. Pogled od spredaj; B. Vzdolžni prerez; povečana kvadratna mreža, velik kvadrat na sredini je komora za štetje 1. Plošča za štetje krvnih celic; 2. pokrovni listič; 3. Pri štetju v štetni komori običajno preštejte skupno število bakterij v petih kvadratih, nato poiščite povprečno vrednost vsakega kvadrata in nato pomnožite s 25 ali 16, da dobite. Skupno število bakterij v velikem kvadratu se nato pretvori v skupno število bakterij v 1 ml raztopine bakterij. Recimo, da je skupno število bakterij v petih srednjih kvadratih A, faktor redčenja bakterijske raztopine pa B. Če gre za števno ploščo s 25 srednjimi kvadratki, potem je skupno število bakterij v 1 ml raztopine bakterij {{ 23}} A/5×25×104× B=50000A·B (kosi) Na enak način, če gre za štetje s 16 kvadrati, skupno število bakterij v 1 ml raztopine bakterij {{ 30}}A/5×16×104×B=32000A·B (kosi),,
