Primerjava različnih mikroskopskih tehnik visoke ločljivosti
Za običajno svetlobno mikroskopijo uklon svetlobe omejuje slikovno ločljivost na približno 250 nm. Danes lahko tehnike super ločljivosti to izboljšajo za več kot faktor 10. Ta tehnika se v glavnem doseže s tremi metodami: enomolekulsko lokalizacijsko mikroskopijo, vključno s fotosenzitivno lokalizacijsko mikroskopijo (PALM) in stohastično optično rekonstrukcijsko mikroskopijo (STORM); mikroskopija s strukturirano osvetlitvijo (SIM); in stimulirana emisijska mikroskopija (STED). Kako izbrati tehnologijo super ločljivosti, je tisto, kar skrbi vsakogar. "Na žalost ni preprostih načel za odločanje, katero metodo uporabiti," pravi Mathew Stracy, podoktorski raziskovalec na Univerzi v Oxfordu v Veliki Britaniji. "Vsak ima svoje prednosti in slabosti." Znanstveniki seveda tudi ugotavljajo, kako izbrati pravo metodo za določen projekt. "V kontekstu bioslikovanja ključni dejavniki, ki jih je treba upoštevati, vključujejo: prostorsko in časovno ločljivost, občutljivost na fotopoškodbe, zmogljivost označevanja, debelino vzorca in fluorescenco ozadja ali celično avtologno fluorescenco." Kako deluje Različni mikroskopi visoke ločljivosti delujejo na različne načine. V primeru PALM in STORM je le majhen del fluorescenčnih markerjev vzburjen ali fotoaktiviran v danem trenutku, kar omogoča njihovo neodvisno lokalizacijo z visoko natančnostjo. Skozi ta postopek z vsemi fluorescentnimi nalepkami dobite popolno sliko v super ločljivosti. Stefan Hell, eden od dobitnikov Nobelove nagrade za kemijo leta 2014 in direktor Inštituta za biofizikalno kemijo Maxa Plancka, je dejal: "Sistem PALM/STORM je razmeroma enostaven za postavitev, vendar ga je težko uporabiti, ker fluorescentna skupina mora imeti sposobnost fotoaktivacije. Omejitve. Pomanjkljivost je, da morajo zaznati eno samo fluorescentno molekulo v kontekstu celice in so manj zanesljivi kot STED." STED uporablja laserski impulz za vzbujanje fluoroforja in laser v obliki obroča za dušenje fluoroforja, pri čemer ostane le vmesna nanometrska fluorescenca za super ločljivost. Skeniranje celotnega vzorca ustvari sliko. "Prednost STED je, da gre za tehnologijo s pritiskom na gumb," je pojasnil Hell. "Deluje kot standardni konfokalni fluorescenčni mikroskop." Prav tako lahko slika žive celice z uporabo fluoroforjev, kot so zeleni ali rumeni fluorescentni proteini in barvila, pridobljena iz rodamina. Parametrična primerjava Čeprav vse tehnike super ločljivosti presegajo konvencionalno svetlobno mikroskopijo glede ločljivosti, se med seboj razlikujejo. SIM približno podvoji ločljivost na približno 100 nm. PALM in STORM lahko razrešita tarče 15 nm. Po Hellu STED zagotavlja prostorsko ločljivost 30 nm v živih celicah in 15 nm v fiksnih celicah. Ko gre za posebne aplikacije, moramo upoštevati tudi razmerje med signalom in šumom. V nekaterih primerih lahko nižja ločljivost, vendar višji SNR, povzroči boljšo sliko kot nasprotno (višja ločljivost, vendar nižji SNR). Zelo pomembna je tudi hitrost pridobivanja slike, še posebej pri živih celicah. "Vse tehnike super ločljivosti so počasnejše od običajnih tehnik fluorescenčnega slikanja," je dejal Stracy. "PALM/STORM je najpočasnejši, potrebuje več deset tisoč sličic, da dobi eno sliko, SIM potrebuje desetine sličic, STED pa je tehnologija skeniranja, zato je hitrost zajema odvisna od velikosti vidnega polja." Poleg živih celic ali fiksnih slikovnih celic želijo nekateri znanstveniki razumeti tudi, kako se predmeti premikajo. Stracyja zanima razumevanje dinamike bioloških sistemov v živih celicah, ne le statične slike. Združuje PALM s sledenjem posameznih delcev za analizo dinamike v živih celicah. Na ta način lahko neposredno sledi markerskim molekulam, ko opravljajo svoje funkcije. Meni pa, da SIM ni primeren za preučevanje teh dinamičnih procesov na molekularni ravni, je pa zaradi svoje hitre hitrosti pridobivanja še posebej primeren za opazovanje dinamike večjih struktur, kot so celotni kromosomi. Najnovejši rezultati Leta 2017 je Hellova ekipa v Science poročala o mikroskopu visoke ločljivosti MINFLUX. Hell pravi, da ta metoda super-ločljivosti prvič doseže prostorsko ločljivost 1 nm. Poleg tega lahko sledi posameznim molekulam v živih celicah vsaj 100-krat hitreje kot druge metode. Tudi drugi znanstveniki so pohvalno govorili o mikroskopu MINFLUX. "Nenehno se razvijajo nove aplikacije in pristopi, vendar me izstopata dva napredka," je dejal Shechtman. Eden je MINFLUX. "Uporablja genialno metodo za zelo natančno molekularno pozicioniranje." Glede drugega vznemirljivega razvoja je Shechtman omenil WE Moernerja in njegove kolege na univerzi Stanford. Moerner je bil leta 2014 tudi prejemnik Nobelove nagrade za kemijo. Eden od zmagovalcev. Da bi odpravili omejitev slikovne ločljivosti, ki jo povzroča anizotropno sipanje fluorescentnih posameznih molekul, so znanstveniki uporabili različne polarizacije vzbujanja za določitev orientacije in položaja molekul. Poleg tega imajo razvite občutljive površine zenic. Te tehnike izboljšajo sposobnost lokalizacije struktur. O fluorescentnih nalepkah V mnogih aplikacijah z visoko ločljivostjo so nalepke resnično pomembne. Nekatera podjetja ponujajo tudi sorodne izdelke. Nemški Miltenyi se je na primer povezal s podjetjem Abberior, ki ga je ustanovil Stefan Hell, da bi zagotovil storitve konjugacije protiteles po meri za barvila za mikroskopijo z visoko ločljivostjo. Številna druga podjetja ponujajo tudi ujemajoče se markerje. »Naši nano-ojačevalci so zelo majhni, le 1,5 kDa, in zelo specifični,« pravi Christoph Eckert, vodja trženja pri ChromoTeku. Ti proteini vežejo zelene in rdeče fluorescentne proteine (GFP in RFP). Izhajajo iz fragmentov protiteles alpake, znanih kot VHH ali nanotelesa, z odličnimi veznimi lastnostmi in stabilno kakovostjo brez variacije od serije do serije. Ti označevalci so primerni za različne tehnike visoke ločljivosti, vključno s SIM, PALM, STORM in STED. Ai-Hui Tang, docent na Medicinski fakulteti Univerze v Marylandu, in njegovi sodelavci so uporabili ChromoTekov GFP-Booster in STORM za raziskovanje širjenja informacij v živčnem sistemu. Našli so molekularne nanoklastre, imenovane nanokolone, v presinaptičnih in postsinaptičnih nevronih. Znanstveniki verjamejo, da ta struktura kaže, da centralni živčni sistem uporablja preprosta načela za vzdrževanje in uravnavanje sinaptične učinkovitosti. Različne različice slikanja v visoki ločljivosti in vse več metod popeljejo znanstvenike še globlje v biološke skrivnosti. S prekoračitvijo meje uklona vidne svetlobe lahko biologi celo "natančno spremljajo" delovanje celic.
