Kako se fluorescenčna mikroskopija razlikuje od običajne mikroskopije
Pred kratkim sem poskušal narediti nekaj zamrznjenih kosov miši, zdaj pa moram uporabiti fluorescenčni mikroskop, da vidim, ali je virus, ki sem ga vbrizgal, v želenem predelu možganov. Na kratko je treba preučiti nekaj osnovnih principov fluorescenčne mikroskopije, ki jih bom tudi delil tukaj.
Fluorescenčni mikroskop uporablja ultravijolično svetlobo kot vir svetlobe za osvetlitev preizkušanega predmeta, zaradi česar predmet oddaja vir svetlobe in nato opazuje predmet pod mikroskopom. Uporablja se predvsem za imunofluorescenčne celice, sestavljen je iz vira svetlobe, sistema filtrirnih plošč in optičnega sistema za opazovanje fluorescenčne slike vzorca s povečavo okularja in leče objektiva. Oglejmo si razliko med tem fluorescenčnim mikroskopom in običajnim optičnim mikroskopom.
1. Glede na načine osvetlitve
Metoda osvetlitve fluorescenčnega mikroskopa na splošno uporablja metodo padajočega žarka, kar pomeni, da se vir svetlobe projicira na preskusni vzorec skozi lečo objektiva.
2. V smislu ločljivosti
Fluorescenčna mikroskopija kot vir svetlobe uporablja ultravijolično svetlobo z relativno kratko valovno dolžino, vendar višjo ločljivostjo kot običajni optični mikroskopi.
3. Razlike na filtru
Fluorescenčni mikroskop uporablja dva posebna filtra, enega pred svetlobnim virom za filtriranje vidne svetlobe, drugega pa med objektivom in okularjem za filtriranje ultravijolične svetlobe, ki lahko zaščiti oči.
Fluorescenčna mikroskopija je tudi vrsta optičnega mikroskopa, predvsem zato, ker je valovna dolžina, ki jo vzbuja fluorescenčna mikroskopija, kratka, kar vodi do razlik v strukturi in uporabi fluorescenčne mikroskopije in običajne mikroskopije. Večina fluorescenčnih mikroskopov ima dobro funkcijo zajemanja šibke svetlobe, zato je njihova sposobnost slikanja dobra tudi pri izjemno šibki fluorescenci. Poleg tega se je z nenehnim izboljševanjem fluorescenčne mikroskopije v zadnjih letih znatno zmanjšal tudi hrup. Zato se uporablja vedno več fluorescenčnih mikroskopov.
Znanje, povezano z dvofotonsko fluorescenčno mikroskopijo
Osnovno načelo dvofotonskega vzbujanja je, da lahko fluorescentne molekule pri visoki gostoti fotonov hkrati absorbirajo dva fotona z dolgo valovno dolžino in po kratkem obdobju tako imenovane življenjske dobe v vzbujenem stanju oddajo foton s krajšo valovno dolžino; Njegov učinek je enak kot pri uporabi fotona z valovno dolžino, ki je polovica dolge valovne dolžine, za vzbujanje fluorescenčnih molekul. Vzbujanje z dvema fotonoma zahteva visoko gostoto fotonov in da bi se izognili poškodbam celic, se v dvofotonskem mikroskopu uporablja visokoenergijski impulzni laser z zaklenjenim načinom. Laser, ki ga oddaja ta tip laserja, ima visoko konično energijo in nizko povprečno energijo, s širino impulza le 100 femtosekund in frekvenco do 80 do 100 megahercev. Pri uporabi objektiva z visoko numerično aperturo za fokusiranje fotonov impulznega laserja je gostota fotonov v gorišču objektiva največja, dvofotonsko vzbujanje pa se pojavi samo v žarišču objektiva. Zato dvofotonski mikroskop ne potrebuje konfokalnih lukenj, kar izboljša učinkovitost detekcije fluorescence.
Pri splošnih pojavih fluorescence lahko zaradi nizke fotonske gostote vzbujanja fluorescenčna molekula absorbira le en foton hkrati in nato odda en fluorescenčni foton skozi prehod sevanja, kar se imenuje enofotonska fluorescenca. Pri procesu vzbujanja fluorescence z uporabo laserja kot vira svetlobe lahko pride do pojava dvofotonske ali celo večfotonske fluorescence. V tem času je uporabljen vir vzbujanja svetlobe visoke intenzivnosti, gostota fotonov pa izpolnjuje zahtevo, da fluorescentne molekule absorbirajo dva fotona hkrati. V procesu uporabe tipičnega laserja kot vzbujalnega vira svetlobe gostota fotonov še vedno ni zadostna za ustvarjanje pojava absorpcije dveh fotonov. Običajno se uporabljajo femtosekundni impulzni laserji, njihova trenutna moč pa lahko doseže raven megavatov. Zato je valovna dolžina dvofotonske fluorescence krajša od valovne dolžine vzbujanja, kar je enako učinku, ki ga povzroči vzbujanje valovne dolžine s polovično vzbujanjem.
