Razlike in značilnosti fluorescenčnega in navadnega optičnega mikroskopa
Fluorescenčni mikroskop in navadni optični mikroskop sta različna, vzorca ne opazujeta z osvetlitvijo običajnega svetlobnega vira, temveč z uporabo določene valovne dolžine svetlobe (običajno ultravijolične, modro-vijolične svetlobe) vzbujanja fluorescenčnega materiala v vzorcu. pod mikroskopom, tako da fluorescenca svetlobnega vira fluorescenčnega mikroskopa ne deluje kot neposredna osvetlitev, ampak kot neke vrste vzbujanje fluorescentnega materiala v vzorcu vira energije. Razlog, zakaj lahko opazujemo vzorec, ni v osvetlitvi svetlobnega vira, temveč v pojavu fluorescence, ki ga predstavlja fluorescenčni material v vzorcu po absorbciji svetlobne energije vzbujanja. Vidimo lahko, da značilnosti fluorescenčnega mikroskopa, predvsem njegov svetlobni vir, lahko zagotovijo veliko število specifičnih valovnih dolžin vzbujevalne svetlobe, tako da lahko fluorescentni material v preiskovanem vzorcu pridobi potrebno intenzivnost vzbujevalne svetlobe. Hkrati mora imeti fluorescenčni mikroskop ustrezen filtrirni sistem. Fluorescenčni mikroskop je osnovno orodje za fluorescenčno histokemijo. Sestavljen je iz svetlobnega vira ultravisokega tlaka, filtrirnega sistema (vključno s filtrirno ploščo za vzbujanje in zatiranje), optičnega sistema in fotografskega sistema ter drugih glavnih komponent, je uporaba določene valovne dolžine svetlobe za spodbujanje vzorca k oddajanju fluorescence.
1. način vzbujanja fluorescence: glede na obseg valovne dolžine je svetloba razdeljena na metodo vzbujanja UV (z ultravijolično osvetlitvijo) in metodo vzbujanja BV (z modro vijolično svetlobo). Dve vrsti metode vzbujanja UV je krajši od 400 nm blizu ultravijolične svetlobe za vzbujanje. Pri tej metodi ni vidne vzbujalne svetlobe, zato opazovana fluorescenca kaže inherentno fluorescenco barvila in je enostavno ločiti specifično fluorescenco na vzorcu od lastne fluorescence tkiva v ozadju.
2. Metoda vzbujanja BV: metoda je osredotočena na 404 nm, 434 nm od ultravijolične do modre svetlobe za vzbujanje. Ta metoda uporablja modro svetlobo za obsevanje vzorca, zato mora izločevalni filter sistema za opazovanje fluorescence uporabljati filter, ki lahko popolnoma blokira modro svetlobo in lahko ustrezno prepušča želeno zeleno in rumeno fluorescenco. Fluorescentni pigmenti za metodo fluorescentnih protiteles. Ker sta valovna dolžina največje absorpcije vzbujalne svetlobe in valovna dolžina največje emisije fluorescence blizu druga drugi, morajo biti filtri, ki se uporabljajo pri metodi vzbujanja BV, filtri z ostro mejo. Ta metoda uporablja modro svetlobo kot vzbujevalno svetlobo, zato je absorpcijska učinkovitost fluorokroma večja in je mogoče dobiti svetlejšo sliko. Pomanjkljivost je, da ni mogoče videti fluorescence pod 500 nm, nad 500 nm pa je celotna slika videti rumena. Pri metodi s fluorescenčnimi protitelesi se večina specifičnosti ocenjuje po edinstveni barvi fluorokroma, zato so slabosti zgoraj opisane metode vzbujanja BV ponavadi izjemno vplivne pri razpravi o subtilni specifičnosti.
