Delovno znanje konfokalne fluorescenčne mikroskopije
Osnovno načelo konfokalne fluorescenčne mikroskopije: Uporabite točkovni vir svetlobe za osvetlitev vzorca, da na goriščni ravnini oblikujete majhno, dobro definirano svetlobno točko. Fluorescenco, ki jo oddaja točka po osvetlitvi, zbere leča objektiva in vrne v dihroično zrcalo vzdolž prvotne svetlobne poti osvetlitve. tvorijo cepilnik žarka. Spektrometer pošlje fluorescenco neposredno v detektor. Pred virom svetlobe in detektorjem je luknjica, ki ju imenujemo luknjica za osvetlitev oziroma luknjica za zaznavanje. Geometrijske mere obeh so skladne, približno 100-200nm; glede na svetlobno točko na goriščni ravnini sta konjugirani, kar pomeni, da svetlobna točka prehaja skozi niz leč in se na koncu lahko istočasno fokusira na luknjico za osvetlitev in luknjico za zaznavanje. Na ta način se lahko svetloba iz goriščne ravnine koncentrira znotraj območja zaznavne luknje, medtem ko je razpršena svetloba nad ali pod goriščno ravnino blokirana zunaj zaznavne luknje in je ni mogoče prikazati. Vzorec se skenira točko za točko z laserjem, fotopomnoževalna cev za detekcijsko luknjico pa pridobi tudi konfokalno sliko ustrezne svetlobe točko za točko, ki se pretvori v digitalni signal in prenese v računalnik ter na koncu združi na zaslon v jasno konfokalno sliko celotne goriščne ravnine. .
Vsaka slika goriščne ravnine je pravzaprav optični prerez vzorca. Ta optični prerez ima vedno določeno debelino in se imenuje tudi optični tanki prerez. Ker je jakost svetlobe v žarišču veliko večja od jakosti svetlobe v negoriščnici in je svetloba nežariščne ravnine filtrirana z luknjico, je globinska ostrina konfokalnega sistema približno nič. S skeniranjem vzdolž smeri osi Z lahko realizirate optično tomografijo, ki oblikuje želeno. Opazujte dvodimenzionalni optični odsek na izostreni točki vzorca. S kombiniranjem skeniranja ravnine XY (goriščne ravnine) s skeniranjem osi Z (optične osi), s kopičenjem neprekinjenih nivojev dvodimenzionalnih slik in njihovo obdelavo s specializirano računalniško programsko opremo, je mogoče dobiti tridimenzionalno sliko vzorca.
To pomeni, da sta zaznavna luknjica in luknjica svetlobnega vira vedno osredotočena na isto točko, tako da fluorescenca, vzbujena zunaj goriščne ravnine, ne more vstopiti v zaznavno luknjico.
Preprost izraz principa delovanja konfokalnega laserja je, da kot vir svetlobe uporablja laser. Na podlagi tradicionalnega slikanja s fluorescenčnim mikroskopom sta dodani naprava za lasersko skeniranje in naprava za konjugirano fokusiranje, sistem pa nadzoruje računalnik za zbiranje in obdelavo digitalnih slik.
