Zakaj moram uporabljati konfokalni mikroskop?
1. Optični mikroskop je bil izpopolnjen s prizadevanji in izboljšavami naših velikih predhodnikov. Pravzaprav nam lahko običajni mikroskop enostavno in hitro zagotovi čudovite mikroskopske slike. Vendar pa je bil dogodek, ki je revolucioniral svet skoraj popolnih mikroskopov, izum "laserskega skenirajočega konfokalnega mikroskopa". Za to novo vrsto mikroskopa je značilen optični sistem, ki slikovno informacijo izloči le s površine, na kateri je osredotočeno, in s spreminjanjem ostrine ob obnavljanju pridobljenih informacij v slikovnem pomnilniku je mogoče pridobiti ostro sliko z popolne 3-dimenzijske informacije. Na ta način je mogoče enostavno pridobiti podatke o obliki površine, ki jih z običajnim mikroskopom ne moremo potrditi. Poleg tega, čeprav sta "povečanje ločljivosti" in "poglabljanje globine fokusa" nasprotujoča si pogoja za običajne optične mikroskope, zlasti pri veliki povečavi, je ta problem rešen s konfokalnimi mikroskopi.
2. Prednosti konfokalnega optičnega sistema
Shema laserskega konfokalnega mikroskopa
Konfokalni optični sistem je točkovna osvetlitev vzorca, odbito svetlobo pa sprejema tudi točkovni receptor. Ko je vzorec postavljen v žariščno točko, skoraj vsa odbita svetloba doseže fotoreceptor, in ko vzorec ni izostren, odbita svetloba ne more doseči fotoreceptorja. Z drugimi besedami, v konfokalnem optičnem sistemu se izpiše le slika, ki sovpada z goriščem, pike in neuporabna razpršena svetloba pa so blokirani.
3. Zakaj uporabljati laser?
V konfokalnem optičnem sistemu je vzorec osvetljen v točki, odbito svetlobo pa sprejme točkovni senzor. Zato je potreben točkovni vir svetlobe. Laserji so v veliki meri točkovni vir svetlobe. V večini primerov je vir svetlobe za konfokalne mikroskope laserski vir svetlobe. Poleg tega so monokromatičnost, usmerjenost in odlična oblika žarka pomembni razlogi za njihovo široko uporabo.
4. Možno je opazovanje v realnem času na podlagi hitrega skeniranja.
Za lasersko skeniranje se v vodoravni smeri uporablja akustična optična odklonska enota (Acoustic Optical Deflector, AO prime), v navpični smeri pa servoelektronsko krmiljeno zrcalo za skeniranje snopa (Servo Galvano-mirror). Ker v AO deflektorju ni mehanskih vibracij, je možno hitro skeniranje in opazovanje na zaslonu monitorja v realnem času. Visoka hitrost te kamere je zelo pomembna postavka, ki neposredno vpliva na hitrost ostrenja in pridobivanja položaja.
5. Razmerje med položajem ostrenja in svetlostjo
V konfokalnem optičnem sistemu je vzorec pravilno postavljen v goriščni položaj, ko je svetlost zui velika, pred in za njim se bo njegova svetlost močno zmanjšala (slika 4 polna črta). Ta občutljiva selektivnost goriščne ravnine je načelo za višinsko usmerjenost konfokalnega mikroskopa in globino razširitve žarišča. Nasprotno pa običajni optični mikroskopi ne kažejo pomembne spremembe svetlosti pred in po položaju žarišča (črtkana črta na sliki 4).
6. Visok kontrast, visoka ločljivost
Pri običajnem optičnem mikroskopu odbita svetloba iz neizostrenega dela mikroskopa moti žariščni del mikroskopa in se z njim prekriva, kar povzroči zmanjšanje kontrasta slike. Nasprotno pa je v konfokalnem optičnem sistemu razpršena svetloba zunaj goriščne točke in znotraj leče objektiva skoraj popolnoma odstranjena, kar povzroči slike z zelo visokim kontrastom. Poleg tega je ločljivost mikroskopa izboljšana, ker svetloba dvakrat preide skozi lečo objektiva in izostri točkovno sliko.
7. Funkcija optične lokalizacije
V konfokalnem optičnem sistemu je odbita svetloba zaščitena z mikroodprtino na točki, ki ni žarišče. Posledično se pri opazovanju tridimenzionalnega vzorca slika oblikuje, kot da bi bil vzorec razrezan z goriščem (slika 5). Ta učinek se imenuje optična lokalizacija in je ena od značilnosti konfokalnih optičnih sistemov.
