Zahteve za pripravo vzorcev za fluorescenčno mikroskopijo

Zahteve za pripravo vzorcev za fluorescenčno mikroskopijo

Zahteve za pripravo vzorca za fluorescenčno mikroskopijo

(1) Predmetno steklo

Debelina diapozitiva mora biti med 0.8-L2 mm. Predebelo stekelce bo po eni strani absorbiralo več svetlobe, po drugi strani pa vzbujevalne svetlobe ne more usmeriti na vzorec. Stekelca morajo biti gladka, enakomerne debeline in brez očitne avtofluorescence. Včasih se uporabljajo kremenčevi diapozitivi.

(2) Pokrivno steklo

Debelina pokrovnega stekla je približno 0,17 mm, gladko. Za okrepitev vzbujalne svetlobe se lahko uporablja tudi interferenčno pokrivno steklo, ki je posebno pokrivno steklo, prevlečeno z več plastmi snovi (kot je magnezijev fluorid), ki imajo različne interferenčne učinke na svetlobo različnih valovnih dolžin, zaradi česar lahko gladka fluorescenca. Vzbujevalna svetloba prehaja skozi, vzbujevalna svetloba se odbije in ta odbita vzbujevalna svetloba lahko vzbuja vzorec.

(3) Vzorec

Rezine tkiva ali drugi vzorci ne smejo biti predebeli. Če je debelina predebela, bo večina vzbujalne svetlobe porabljena v spodnjem delu vzorca, medtem ko zgornjega dela, ki ga neposredno opazuje leča objektiva, ni mogoče v celoti vzbujati. Poleg tega na presojo vpliva fluorescenca, ki jo povzročajo prekrivajoče se celice ali nečistoče, nespecifično obarvanje ozadja.

(4) olje za ogledalo

Na splošno je treba pri opazovanju vzorcev s fluorescenčnimi mikroskopi s temnim poljem in oljnimi imerzijskimi mikroskopi uporabiti imerzijsko olje. Najbolje je uporabiti posebno nefluorescentno potopno olje. Namesto tega lahko uporabimo tudi glicerin, lahko tudi tekoči parafin, vendar je lomni količnik nizek, kar nekoliko vpliva na kakovost slike.

Razumevanje svetlobne kocke fluorescenčne mikroskopije

Fluorescenca je svetloba, pri kateri elektroni v snovi absorbirajo svetlobno energijo iz nizkoenergetskega stanja v visokoenergijsko stanje in nato sprostijo svetlobo, ko se vrne v nizkoenergijsko stanje. To je netemperaturna sevana svetloba - luminiscenca. To je: snov absorbira kratkovalovno svetlobo, preide v vzbujeno stanje in oddaja dolgovalovno svetlobo.

Ne glede na to, ali gre za avtofluorescenco snovi, fluorescentnega barvila ali fluorescenčnega proteina, izraženega s fuzijo, ga je treba vzbuditi s specifično valovno dolžino svetlobe (vzbujanje). Ko elektroni migrirajo in izgubijo energijo, oddajajo svetlobo določene dolge valovne dolžine (Emisija). , ki jih lahko zbere sistem za zaznavanje, da se doseže funkcija prepoznavanja specifične fluorescence.

Kaj je fluorescenčna kocka?

Pri opazovanju in slikanju s fluorescenčnim mikroskopom vzbujevalno svetlobo določene valovne dolžine in ustrezno dolgovalovno emisijsko svetlobo zagotavlja fluorescenčna svetlobna kocka, tako da je mogoče fluorescenčni signal zbrati s prostim očesom, zaslonom ali kamero. Zato fluorescenčna svetlobna kocka določa, kaj je mogoče zaznati. Ključna naprava fluorescenčnega signala, njene značilnosti vključujejo EX: parametre filtra valovne dolžine vzbujanja, EM: parametre filtra valovne dolžine emisije in DM: parametre dihotomnega zrcala. Za primer vzemite svetlobno kocko DAPI integriranega fluorescenčnega mikroskopa Revolve, EX: 385/30, EM: 450/50, DM: 425.

The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >425nm svetloba se lahko prenaša na EM; EM emisijski filtri se uporabljajo za ločevanje fluorescence, ki jo oddaja fluorofor, od drugega ozadja. Optični elementi za ločevanje svetlobe. Emisijski filtri prepuščajo svetlobo na valovni dolžini fluorescence skozi dihroično zrcalo, medtem ko blokirajo vso drugo svetlobo, ki uhaja iz vzbujalnega svetlobnega vira (odbita od vzorca ali optike). Valovna dolžina oddane svetlobe je večja od EM, ki jo je treba opazovati, kar pomeni, da v sistem zaznavanja vstopi le svetloba v območju 450±25 n. Pravilna izbira EX, EM filtrov in dihotomij DM lahko pomaga raziskovalcem doseči višja razmerja signal/šum (S/N).