Kako izbrati ustrezen fluorescenčni mikroskop
Fluorescenčni mikroskop je standardna oprema za mikroskopsko slikanje v laboratorijih in patoloških oddelkih, ki uporablja fluorescenčne značilnosti za opazovanje in slikanje. Široko se uporablja na različnih področjih, kot so celična biologija, nevrobiologija, botanika, mikrobiologija, patologija, genetika itd. Fluorescenčno slikanje ima prednosti visoke občutljivosti in specifičnosti, zaradi česar je zelo primerno za opazovanje porazdelitve specifičnih proteinov, organelov itd. .v tkivih in celicah, preučevanje kolokalizacije in interakcij, sledenje življenjskim dinamičnim procesom, kot so spremembe koncentracije ionov itd.
Izbor mikroskopov
Fluorescenčni mikroskopi so večinoma razdeljeni v tri kategorije: pokončni fluorescenčni mikroskopi (primerni za rezanje), invertni fluorescenčni mikroskopi (primerni za žive celice in tudi za rezanje) in stereo fluorescenčni mikroskopi (primerni za večje primerke, kot so rastline, cebrice (odrasle/ embrionalni), medaka, mišji/podganji organi itd.).
Izbira fluorescentnih filtrskih blokov
Pri izbiri filtrirnih blokov je treba upoštevati ne samo valovne dolžine vzbujanja in emisije fluorescenčnih sond, temveč tudi, ali obstaja nespecifično vzbujanje in ali obstaja preslušavanje barv za večbarvno označene vzorce. V poskusu bomo izbrali valovno dolžino, ki je najbližja vrhu vzbujanja, kolikor je to mogoče za vzbujanje, sprejemno območje pa mora vključevati najvišjo emisijo. Vzbujevalni vrh Alexa Fluor 488 je 500 nm, v fluorescenčnem mikroskopu pa je mogoče izbrati vzbujevalni filter 480/40. Običajno uporabljene bloke fluorescentnih filtrov v fluorescenčni mikroskopiji lahko razdelimo na dve vrsti: dolgi prehod (LP) in pasovni prehod (BP), ki ju je prav tako treba izbrati glede na potrebe.
Konfokalni mikroskop
Pri tradicionalnih opazovanjih s fluorescenčno mikroskopijo so zaradi prekrivanja fluorescenčno označenih snovi in spontanih fluorescenčnih struktur tesno povezane. Vendar pa tradicionalni padajoči fluorescenčni mikroskopski objektivi ne le zbirajo svetlobo iz goriščne ravnine, ampak tudi razpršijo svetlobo gor in dol po goriščni ravnini, kar povzroči znatno zmanjšanje ločljivosti slike in kontrasta.
Konfokalno slikanje zazna le svetlobo, ki se odbije od ravnine samofokusiranja, in tako reši zgornji problem. Vir svetlobe tvori majhno in fino točko na goriščni ravnini skozi luknjico, svetloba, ki jo oddaja goriščna ravnina, pa se zbira skozi lečo objektiva. Večina fluorescence, ki jo oddajajo točke nad ali pod goriščno ravnino leče objektiva, ne more konvergirati k luknjici. Samo fluorescenca, ki se nahaja v goriščni ravnini, in majhen del defokusirane fluorescence lahko preide skozi luknjico, medtem ko se svetlobni žarek zunaj goriščne ravnine zbliža pred ali za ploščo z luknjico in je blokiran, da vstopi v detektor skozi luknjico. Zaznana slika je iz goriščne ravnine, zato je končna kakovost slike močno izboljšana.
Zaradi različnih prednosti in praktičnosti konfokalne mikroskopije z laserskim skeniranjem je trenutno nepogrešljiv eksperimentalni pomočnik na področjih visoko natančne celične biologije, botanike in raziskovanja celic. Hkrati pa bo v bodočih znanstvenoraziskovalnih središčih najbolj osnovno in temeljno raziskovalno orodje.
