Opazovanje fluorescence z optičnim mikroskopom
Fluorescenca se nanaša na proces, pri katerem fluorescentna snov oddaja svetlobo z daljšo valovno dolžino skoraj istočasno, ko je obsevana s svetlobo določene valovne dolžine (slika 1). Ko svetloba določene valovne dolžine (valovna dolžina vzbujanja) zadene molekulo, na primer tiste v fluoroforju, energijo fotona absorbirajo elektroni molekule. Nato elektroni preidejo iz osnovnega stanja (S0) v višjo energijsko raven, v vzbujeno stanje (S1'). Ta proces se imenuje vzbujanje①. Elektron ostane v vzbujenem stanju 10-9–10-8 sekund, med tem pa izgubi nekaj energije②. Med procesom, ko elektroni zapustijo vzbujeno stanje (S1) in se vrnejo v osnovno stanje③, se sprosti preostala energija, absorbirana med postopkom vzbujanja.
Fluorescentni diagram Jablonskega
Čas zadrževanja fluorescentne molekule v vzbujenem stanju je življenjska doba fluorescence, ki je običajno na ravni nanosekund in je lastna značilnost same fluorescenčne molekule. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), ki uporablja tehnologijo fluorescence Lifetime Imaging, lahko poleg slikanja intenzitete fluorescence izvede bolj poglobljene funkcionalne meritve in pridobi molekularno konformacijo, medmolekulske interakcije in mikrookolje molekul itd. Informacije, ki jih je težko razbrati pridobite z običajnim optičnim slikanjem.
Druga pomembna lastnost fluorescence je Stokesov premik, razlika v valovni dolžini med vrhoma vzbujanja in emisij (slika 2). Običajno je valovna dolžina emisije daljša od valovne dolžine vzbujanja. To je zato, ker bodo elektroni izgubili del svoje energije skozi proces relaksacije, potem ko je fluorescenčna snov vzbujena in preden se sprostijo fotoni. Fluorescentne snovi z večjimi Stokesovimi premiki je lažje opazovati pod fluorescenčnim mikroskopom.
fluorescenčni mikroskop
Fluorescenčni mikroskop je optični mikroskop, ki uporablja lastnosti fluorescence za opazovanje in slikanje ter se pogosto uporablja na različnih področjih, kot so celična biologija, nevrobiologija, botanika, mikrobiologija, patologija in genetika. Fluorescenčno slikanje ima prednosti visoke občutljivosti in visoke specifičnosti ter je zelo primerno za opazovanje porazdelitve specifičnih proteinov in organelov v tkivih in celicah, preučevanje kolokalizacije in interakcij, sledenje življenjskim dinamičnim procesom, kot so spremembe koncentracije ionov itd.
Večina molekul v celicah ne fluorescira in če jih želite videti, jih označite fluorescentno. Obstaja veliko metod fluorescenčnega označevanja, kot je neposredno označevanje (kot je uporaba DAPI za označevanje DNK) ali imunsko barvanje z uporabo lastnosti protiteles, ki vežejo antigen, ali uporaba fluorescenčnih proteinov (kot je GFP, zeleni fluorescentni protein) za označevanje ciljnih proteinov , in reverzibilno vezavo. sintetična barvila (kot je Fura-2) itd.
Invertni fluorescenčni mikroskop MF53-N
Trenutno je fluorescenčni mikroskop postal standardna oprema za slikanje različnih laboratorijev in platform za slikanje ter je dober pomočnik pri naših vsakodnevnih poskusih. Fluorescenčni mikroskopi so v glavnem razdeljeni v tri kategorije: pokončni fluorescenčni mikroskopi (primerni za reze), invertni fluorescenčni mikroskopi (primerni za žive celice, ob upoštevanju rezov), fluorescenčni stereoskopi (primerni za večje primerke, kot so rastline, cebrice (odrasle osebe/zarodki). ), medaka, mišji/podganji organi itd.).
Tehnologija slikanja s fluorescenčno mikroskopijo se pogosto uporablja in ima veliko vrst, nove tehnologije pa se še vedno pojavljajo. Izberete lahko tehnologijo za dokončanje lastne raziskave.
