Razlike ter prednosti in slabosti med transmisijsko fluorescenčno mikroskopijo in refleksijsko fluorescenčno mikroskopijo
1. Transmisijski fluorescenčni mikroskop: Vzbujevalni svetlobni vir se prenaša skozi material vzorca skozi kondenzator, da vzbudi fluorescenco. Običajno uporabljeni koncentratorji temnega polja ali navadni koncentratorji se lahko uporabljajo za prilagoditev reflektorja za pretvorbo vzbujevalne in stranske svetlobe na vzorec. To je razmeroma staromoden fluorescenčni mikroskop. Njegova prednost je močna fluorescenca pri majhnih povečavah, slabost pa, da z naraščajočo povečavo njegova fluorescenca slabi. Zato je bolje opazovati materiale večjih vzorcev.
2. Fluorescenčni mikroskop s padajočim žarkom: To je nova vrsta fluorescenčnega mikroskopa, ki se je razvil v sodobnem času. Za razliko od prejšnjega, vzbujevalna svetloba pade z leče objektiva na površino vzorca, pri čemer se uporablja ista leča objektiva kot osvetljevalni kondenzor in leča objektiva za zbiranje fluorescence. Optični poti je treba dodati dvobarvni separator žarkov, ki s fotouranijem tvori kot 45 stopinj. Vzbujevalna svetloba se odbije v lečo objektiva in se zbere na vzorcu. Fluorescenca, ki jo ustvari vzorec, in vzbujevalna svetloba, ki se odbije od površine leče objektiva in pokrovnega stekla, istočasno vstopita v lečo objektiva in se vrneta v dvobarvni ločevalnik žarkov, pri čemer ločita vzbujevalno svetlobo in fluorescenco. Preostalo vzbujevalno svetlobo nato absorbira blokirni filter. Če se uporabljajo različne kombinacije vzbujevalnih filtrov, dvobarvnih separatorjev žarkov in blokirnih filtrov, lahko zadostijo potrebam različnih fluorescentnih reakcijskih produktov. Prednosti tega fluorescenčnega mikroskopa so enakomerna osvetlitev vidnega polja, čista slika in močnejša fluorescenca z večjo povečavo.
Prednosti in slabosti transmisijske fluorescenčne mikroskopije
Vir svetlobe: visokotlačna živosrebrna žarnica ali halogenska žarnica.
Reflektor z reflektorjem: uporaba reflektorja s temnim poljem za ločevanje vzbujanja in fluorescence.
Objektiv: Uporabite lahko katero koli vrsto objektiva.
Primerek: Tanki primerki so primernejši za opazovanje prenosa.
Prednosti: ① Zaradi uporabe kondenzorja temnega polja vzbujevalna svetloba ne more vstopiti v lečo objektiva, zaradi česar je enostavno oblikovati temno ozadje in doseči dober kontrast, za opazovanje pa je mogoče uporabiti katero koli lečo objektiva. ② Pri uporabi objektiva z majhno povečavo je ta svetlejši od odbojnega fluorescenčnega mikroskopa.
Slabost: Središče in višina reflektorja morata biti pravilno nastavljena, sicer ni mogoče dobiti svetle fluorescentne slike. Zaradi omejitve goriščne razdalje reflektorja s temnim poljem ni mogoče uporabiti debelih steklenih diapozitivov. Območje osvetlitve vidnega polja ne sme biti preveliko, sicer lahko povzroči bledenje fluorescenčne barve fluorescentnega vzorca. Debeli ali neprozorni vzorci niso primerni.
Prednosti in slabosti reflektivne fluorescenčne mikroskopije
Vir svetlobe: visokotlačna živosrebrna žarnica ali halogenska žarnica.
Leča za ostrenje: Ker leča objektiva služi kot leča za ostrenje, leča za ostrenje ni potrebna.
Objektiv: uporabljena objektiva mora biti sposobna prepuščati zadostno količino ultravijolične svetlobe in sama ne sme proizvajati fluorescence, brez omejitev numerične aperture.
Vzorec: opazujemo lahko tako debele kot neprozorne vzorce.
Prednosti: ① Ker leča objektiva služi tudi kot reflektor, ne zahteva veliko prilagajanja. ② Z uporabo metode osvetlitve Kolar je mogoče izkoristiti učinke zaslonke in zaslonke vidnega polja. Numerična zaslonka objektiva ni omejena, slike visoke ločljivosti pa je mogoče dobiti tudi pri veliki povečavi. Prav tako je mogoče uporabiti debele ali neprozorne vzorce opazovati in uporabiti je mogoče tudi debela pokrovna stekelca Druge metode opazovanja je mogoče kombinirati tudi z odbito fluorescenco, zlasti z metodo fazne razlike in metodo diferencialne interference pri prenosu. S tem se lahko izognemo nepotrebnemu pojavu bledenja barve fluorescence.
Slabost: Pri uporabi talnega povečave je slika razmeroma temna, zato je treba uporabiti objektiv z visoko numerično aperturo. Filtrirni sistem mora učinkovito ločevati vzbujevalno luminiscenco in fluorescenco.,
