Določanje števila mikroorganizmov - metoda neposrednega štetja mikroskopa!
Rast bakterijske populacije se kaže s povečanjem števila celic ali povečanjem celične mase. Metode za določanje števila celic vključujejo metodo štetja z neposrednim mikroskopom, metodo štetja kolonij na ploščah, metodo razmerja fotoelektričnega olja, metodo največje verjetnosti in metodo membranske filtracije. Metode merjenja celične snovi vključujejo določanje suhe mase celic, določanje določenih celičnih komponent, kot so vsebnost dušika, RNK in DNK, ter določanje metabolitov. Skratka, obstaja veliko metod za merjenje rasti mikroorganizmov, vsaka s svojimi prednostmi in slabostmi in jih je treba izbrati glede na specifično situacijo. Ta poskus v glavnem uvaja metodo neposrednega štetja z mikroskopom, ki se običajno uporablja v proizvodnji in znanstvenih raziskavah.
1. Zahteve glede namena
1. Pojasnite princip štetja krvnih celic.
2. Obvladati metodo štetja mikroorganizmov s števcem krvnih celic.
2. Osnovna načela
Metoda neposrednega štetja z mikroskopom je preprosta, hitra in intuitivna metoda za neposredno štetje majhne količine suspenzije vzorca, ki se testira na posebnem stekelcu z določeno površino in prostornino (znan tudi kot števec bakterij). Metode. Trenutno so pogosto uporabljeni števci bakterij doma in v tujini: plošča za štetje krvnih celic, števec bakterij Peteroff-Hauser in števec bakterij Hawksley itd. Uporabljajo se lahko za štetje kvasovk, bakterij, spor plesni in drugih suspenzij ter osnovni princip je enak. Slednji dve vrsti števcev bakterij imata skupno prostornino 0.02 mm3, potem ko sta pokrita s pokrovnim steklom, razdalja med pokrovnim steklom in stekelcem pa je samo 0,02 mm, tako da olje imerzijsko lečo objektiva je mogoče uporabiti za opazovanje in opazovanje majhnih celic, kot so bakterije. štetje. Poleg teh bakteriometrov obstaja tudi metoda ocenjevanja razmerja med površino brisa in površino vidnega polja, opazovanega neposredno pod mikroskopom, ki se običajno uporablja za bakteriološko preiskavo mleka. Prednosti mikroskopske metode neposrednega štetja so intuitivna, hitra in enostavna uporaba. Pomanjkljivost te metode pa je, da je izmerjeni rezultat običajno vsota mrtvih in živih celic. Trenutno obstaja nekaj metod za odpravo te pomanjkljivosti, kot je kombinacija mikrokomorne kulture, ki obarva žive bakterije (kratek čas) in dodajanje inhibitorjev celične delitve, da se doseže namen štetja samo živih bakterij.
V tem poskusu je bil kot primer za neposredno mikroskopsko štetje uporabljen hemocitometer. Za uporabo drugih dveh vrst števcev bakterij glejte navodila posameznega proizvajalca. Štetje neposredno pod mikroskopom s hemocitometrom je pogosto uporabljena metoda za štetje mikroorganizmov. Štetje plošče je posebno steklo, na katerem so tri ploščadi oblikovane s štirimi režami; širša ploščad v sredini je s kratko prečno režo razdeljena na dve polovici, na vsaki strani ploščadi pa je mreža. Vsaka mreža je razdeljena na devet velikih kvadratov, velik kvadrat na sredini pa je soba za štetje. Struktura plošče za štetje krvnih celic je prikazana na sliki l{{{{10}}}}. Lestvica sobe za štetje ima na splošno dve specifikaciji, ena je velik kvadrat, razdeljen na 25 srednjih kvadratov, vsak srednji kvadrat pa je razdeljen na 16 majhnih kvadratov (slika 15-2); drugi je velik kvadrat. Kvadrat je razdeljen na 16 srednjih kvadratov, vsak srednji kvadrat pa je razdeljen na 25 majhnih kvadratov, vendar ne glede na vrsto štetja je v vsakem velikem kvadratu 400 majhnih kvadratov. Stranska dolžina vsakega velikega kvadrata je 1 mm, ploščina vsakega velikega kvadrata pa 1 mm2. Po prekrivanju s pokrovnim steklom je višina med pokrovnim steklom in diapozitivom 0,1 mm, tako da je prostornina števne komore 0,lmm3 (ena tisočinka mililitra). Slika 15-1 Struktura plošče za štetje krvnih celic (1) Slika 15-2 Struktura plošče za štetje krvnih celic (2) A. Pogled od spredaj; B. Vzdolžni prerez; Povečana mreža, velik kvadrat na sredini je komora za štetje 1. Krvne celice Plošča za štetje; 2. Pokrivno steklo; 3. Pri štetju v štetni komori običajno preštejte skupno število bakterij v petih kvadratih, nato izračunajte povprečje vsakega kvadrata in pomnožite s 25 ali 16, da dobite. Skupno število bakterij v velikem kvadratu se nato pretvori v skupno število bakterij v 1 ml raztopine bakterij. Naj bo skupno število bakterij v petih kvadratih A, razmerje redčenja bakterijske raztopine pa B. Če gre za števno ploščo s 25 kvadratki, je skupno število bakterij v 1 ml bakterijske raztopine {{26} } A/5×25×104× B=50000A·B(kosi) Podobno, če gre za števno ploščo s 16 srednjimi kvadrati, skupno število bakterij v 1 ml bakterijske raztopine=A/ 5×16×104×B=32000A·B (kosi)
3. Oprema
1. Bakterije
Saccharomyces cerevisiae
2. Instrumenti ali drugi pripomočki
Hemocitometer, mikroskop, pokrovno stekelce, sterilna kapilarna kapalka.
4. Koraki delovanja
1. Priprava bakterijske suspenzije
Saccharomyces cerevisiae smo pripravili bakterijsko suspenzijo ustrezne koncentracije s sterilno fiziološko raztopino.
2. Prostor za štetje mikroskopa
Pred dodajanjem vzorcev mikroskopsko preglejte števno komoro števne plošče. Če je umazanija, jo je treba pred štetjem očistiti in posušiti.
3. Dodajte vzorec
Čist in suh hemocitometer pokrijte s pokrovnim stekelcem, nato pa s sterilno kapilarno kapalko kapnite majhno kapljico pretresene suspenzije Saccharomyces cerevisiae z roba pokrovnega stekelca in pustite, da se bakterijska raztopina samodejno premika vzdolž reže s kapilarno osmozo. Ob vstopu v prostor za štetje se splošni prostor za štetje lahko napolni z bakterijsko tekočino. Pri vzorčenju najprej pretresite raztopino bakterij; pri dodajanju vzorcev se v števni komori ne smejo ustvarjati zračni mehurčki.
4. Mikroskopsko štetje
Po dodajanju vzorca mirujte 5 minut, nato postavite hemocitometer na stojalo mikroskopa, najprej poiščite lokacijo komore za štetje z mikroskopom majhne moči in nato preklopite na mikroskop visoke moči za štetje. Ustrezno prilagodite jakost svetlobe mikroskopa. Pri mikroskopih, ki za osvetljevanje uporabljajo zrcala, bodite pozorni, da ne odstopate od ene strani svetlobe, sicer ne boste zlahka videli kvadratnih črt števne sobe v vidnem polju ali pa bodo le navpične ali vodoravne črte biti viden. Če se pred štetjem ugotovi, da je raztopina bakterij preveč koncentrirana ali preveč razredčena, je treba redčenje pred štetjem ponovno prilagoditi. Na splošno redčenje vzorca zahteva približno 5 do 10 bakterij v vsaki majhni celici. Vsaka štetna komora izbere 5 srednjih celic (po izbiri 4 vogali in ena srednja celica v sredini) za štetje. Celice, ki se nahajajo na mrežni črti, se običajno štejejo le na zgornji in desni črti. V primeru brstenja kvasovk, ko velikost popka doseže polovico matične celice, se šteje kot dve bakterijski celici. Za štetje vzorca izračunajte vsebnost bakterij v vzorcu tako, da izračunate povprečno vrednost iz dveh štetnih komor.
5. Operite krvne celice
Po uporabi ploščo za štetje krvnih celic sperite z vodo iz pipe, ne drgnite s trdimi predmeti in jo po pranju posušite sami ali s sušilcem za lase. Mikroskopski pregled za opazovanje, ali so v vsaki majhni celici ostanki bakterij ali drugih usedlin. Če ni čist, ga je treba večkrat oprati, dokler ni čist.
