Zakaj potrebujemo konfokalno mikroskopijo?
1. Po prizadevanjih in izboljšavah naših velikih predhodnikov je optični mikroskop dosegel popolno raven. Pravzaprav nam lahko običajni mikroskopi preprosto in hitro zagotovijo čudovite mikroskopske slike. Vendar pa se je zgodil dogodek, ki je prinesel revolucionarno inovacijo v ta skoraj popoln svet mikroskopov, to je bil izum "laserskega skenirajočega konfokalnega mikroskopa". Značilnost te nove vrste mikroskopa je, da sprejme optični sistem, ki samo izvleče informacije o sliki na površini, kjer je fokus koncentriran. S spreminjanjem fokusa in obnavljanjem pridobljenih informacij v slikovnem pomnilniku lahko pridobi žive slike s popolno 3D informacijsko inteligenco. S to metodo je mogoče zlahka pridobiti podatke o obliki površine, ki jih ni mogoče potrditi z običajnimi mikroskopi. Poleg tega sta za tipične optične mikroskope "povečanje ločljivosti" in "poglabljanje žariščne globine" protislovna pogoja, zlasti pri veliki povečavi. Vendar pa je v konfokalnih mikroskopih ta problem enostavno rešljiv.
2. Prednosti konfokalnih optičnih sistemov
Za točkovno osvetlitev vzorca se uporablja konfokalni optični sistem, odbito svetlobo pa sprejema tudi točkovni senzor. Ko je vzorec postavljen v gorišče, lahko skoraj vsa odbita svetloba doseže senzor. Ko vzorec odstopa od goriščne točke, odbita svetloba ne more doseči senzorja. To pomeni, da bo v konfokalnem optičnem sistemu prikazana samo slika, ki sovpada z žariščem, točka in neuporabna razpršena svetloba pa bosta zaščiteni.
Zakaj uporabljati laser?
V konfokalnih optičnih sistemih se na vzorec uporabi točkasta osvetlitev, odbito svetlobo pa sprejme tudi točkovni senzor. Zato so postali potrebni točkovni viri svetlobe. Laser je zelo točkovni vir svetlobe. V večini primerov je vir svetlobe pri konfokalni mikroskopiji laser. Poleg tega so monokromatičnost, usmerjenost in odlična oblika žarka laserjev prav tako pomembni razlogi za njihovo široko uporabo.
4. Možno je opazovanje v realnem času na podlagi hitrega skeniranja
Lasersko skeniranje uporablja akustični optični reflektor (AO) v vodoravni smeri in Servo Galvano zrcalo v navpični smeri. Zaradi odsotnosti mehanskih vibracij v avdio optični prednapetostni enoti je možno izvajati hitro skeniranje in opazovanje v realnem času na nadzornem zaslonu. Visoka hitrost te vrste kamer je zelo pomemben dejavnik, ki neposredno vpliva na hitrost ostrenja in iskanja položaja.
5. Razmerje med lego žarišča in svetlostjo
V konfokalnem optičnem sistemu, ko je vzorec pravilno nameščen v goriščni položaj, je svetlost visoka, svetlost pa se močno zmanjša pred in za njim (polna črta na sliki 4). Občutljiva selektivnost te goriščne ravnine je ravno načelo za določanje smeri višine in razširitev globine žarišča v konfokalni mikroskopiji. V primerjavi s tem tipični optični mikroskopi ne kažejo bistvenih sprememb svetlosti pred in po položaju žarišča (črtkana črta na sliki 4).
6. Visok kontrast in ločljivost
Tipičen optični mikroskop se zaradi motenj, ki jih povzroča odbita svetloba, ki odstopa od žarišča, prekriva z žariščnim slikovnim delom, kar povzroči zmanjšanje kontrasta slike. Nasprotno pa sta pri konfokalnih optičnih sistemih razpršena svetloba zunaj žarišča in razpršena svetloba znotraj leče objektiva skoraj popolnoma odstranjeni, tako da dobimo slike z zelo visokim kontrastom. Poleg tega zaradi dejstva, da gre svetloba skozi lečo objektiva dvakrat, postane točkasta slika najprej ostrejša, kar izboljša tudi ločljivost mikroskopa.
