Kaj je dvofotonska fluorescenčna mikroskopija
Osnovno načelo dvofotonskega vzbujanja je: v primeru visoke gostote fotonov lahko fluorescentne molekule absorbirajo dva fotona z dolgo valovno dolžino hkrati in oddajajo foton s krajšo valovno dolžino po kratkem obdobju tako imenovane življenjske dobe v vzbujenem stanju. . ; učinek je enak, kot če bi uporabili foton, katerega valovna dolžina je polovica dolge valovne dolžine, da vzbudimo fluorescentno molekulo. Dvofotonsko vzbujanje zahteva visoko gostoto fotonov. Da ne bi poškodovali celic, dvofotonska mikroskopija uporablja visokoenergijske impulzne laserje z zaklenjenim načinom. Laser, ki ga oddaja ta laser, ima visoko temensko energijo in nizko povprečno energijo, njegova impulzna širina je le 100 femtosekund, njegova frekvenca pa lahko doseže 80 do 100 megahercev. Pri uporabi leče objektiva z visoko numerično odprtino za fokusiranje fotonov impulznega laserja je gostota fotonov v gorišču leče objektiva največja, dvofotonsko vzbujanje pa se pojavi samo v gorišču leče objektiva, tako da dvofotonski mikroskop ne potrebuje konfokalne luknjice, kar izboljša učinkovitost zaznavanja fluorescence.
Pri splošnih pojavih fluorescence lahko zaradi nizke gostote fotonov vzbujalne svetlobe fluorescenčna molekula absorbira le en foton hkrati in nato odda fluorescenčni foton skozi sevalni prehod, ki je enofotonska fluorescenca. Pri procesu vzbujanja fluorescence z uporabo laserja kot vira svetlobe lahko pride do dvofotonske ali celo večfotonske fluorescence. V tem času je intenzivnost uporabljenega vzbujalnega svetlobnega vira visoka, gostota fotonov pa ustreza zahtevam fluorescenčnih molekul, ki absorbirajo dva fotona hkrati. V procesu uporabe splošnega laserja kot vzbujalnega vira svetlobe gostota fotonov še vedno ni dovolj, da bi povzročil pojav dvofotonske absorpcije. Običajno se uporablja femtosekundni impulzni laser, njegova trenutna moč pa lahko doseže megavatov. Zato je valovna dolžina dvofotonske fluorescence krajša od valovne dolžine vzbujalne svetlobe, kar je enakovredno učinku, ki ga povzroči vzbujanje pri polovici vzbujalne valovne dolžine.
