Dvofotonska fluorescenčna mikroskopija ima številne prednosti:
1) Na daljše valovne dolžine svetlobe manj vpliva sipanje kot na krajše valovne dolžine svetlobe, ki prodrejo skozi vzorec;
(2) Fluorescentne molekule zunaj goriščne ravnine niso vzbujene, tako da lahko več vzbujevalne svetlobe doseže goriščno ravnino, tako da lahko vzbujevalna svetloba prodre globlje v vzorec;
3) daljše valovne dolžine bližnje infrardeče svetlobe so manj strupene za celice kot krajše valovne dolžine;
4) Pri uporabi dvofotonskega mikroskopa za opazovanje vzorca sta fotobeljenje in fototoksičnost prisotni le v goriščni ravnini. Zato so dvofotonski mikroskopi primernejši od enofotonskih mikroskopov za opazovanje debelih vzorcev, za opazovanje živih celic ali za izvajanje poskusov točkovnega fotobeljenja.
Poznavanje konfokalnega fluorescenčnega mikroskopa
Osnovno načelo konfokalnega fluorescenčnega mikroskopa: za obsevanje vzorca se uporablja točkovni vir svetlobe, ki tvori majhno, dobro definirano svetlobno točko na goriščni ravnini. Fluorescenco, oddano s te točke po obsevanju, zbere leča objektiva in pošlje nazaj v razdelilnik žarkov, ki ga sestavlja dvosmerno kromatsko zrcalo vzdolž prvotne svetlobne poti obsevanja. Razdelilnik žarka pošlje fluorescenco neposredno v detektor. Tako vir svetlobe kot detektor imata pred seboj luknjico, imenovano luknjica za osvetljevanje oziroma luknjica za zaznavanje. Obe imata enako geometrijo, približno 100-200 nm, in sta konjugirani glede na svetlobno točko na goriščni ravnini, tj. svetlobna točka prehaja skozi niz leč in se na koncu lahko fokusira na obe svetleči in detektorske luknjice. Na ta način lahko svetloba iz goriščne ravnine konvergira znotraj odprtine sonde, medtem ko je razpršena svetloba nad ali pod goriščno ravnino blokirana zunaj odprtine sonde in je ni mogoče prikazati. Laser skenira vzorec točko za točko, fotopomnoževalna cev pa po zaznavi luknjice dobi tudi konfokalno sliko ustrezne svetlobne točke točko za točko, ki se pretvori v digitalni signal in prenese v računalnik ter končno konvergira v jasno sliko. konfokalna slika celotne goriščne ravnine na zaslonu.
Vsaka slika goriščne ravnine je pravzaprav optični prerez vzorca in ta optični prerez ima vedno določeno debelino, znano tudi kot optična plošča. Ker je intenzivnost svetlobe v žariščni točki veliko večja kot v negoriščni točki in je svetloba nežariščne ravnine filtrirana z luknjico, je globinska ostrina konfokalnega sistema približno enaka nič in skeniranje vzdolž smeri osi Z omogoča optično tomografijo, da oblikuje dvodimenzionalni optični rez vzorca, ki ga je treba opazovati na žarišču. S kombinacijo skeniranja ravnine XY (goriščne ravnine) s skeniranjem osi Z (optične osi) je mogoče dobiti tridimenzionalno sliko vzorca s kopičenjem zaporednih plasti dvodimenzionalnih slik, ki jih obdeluje specializirana računalniška programska oprema.
To pomeni, da sta zaznavna luknjica in luknjica svetlobnega vira vedno fokusirana na isto točko, tako da fluorescenca, vzbujena zunaj goriščne ravnine, ne more priti v zaznavno luknjo.
Načelo delovanja laserskega konfokalnega laserja je preprosto izraženo, da uporablja laser kot svetlobni vir na podlagi tradicionalnega slikanja s fluorescenčnim mikroskopom, dodatne naprave za lasersko skeniranje in naprave za konjugirano fokusiranje, prek računalniškega nadzora za izvajanje sistema za pridobivanje in obdelavo digitalne slike.
