Obstajata dve vrsti fluorescenčnih mikroskopov glede na njihove optične poti:
1. Transmisijski fluorescenčni mikroskop: vir vzbujanja svetlobe se uporablja za vzbujanje fluorescence s prehodom skozi material vzorca skozi zbiralno lečo. Uporabijo se lahko tudi običajno uporabljeni koncentratorji temnega polja, običajni koncentratorji pa se lahko uporabljajo za nastavitev reflektorja, da preusmeri in stransko usmeri vzbujevalno svetlobo na vzorec. To je razmeroma star-fluorescenčni mikroskop. Njegova prednost je močna fluorescenca pri majhni povečavi, slabost pa je, da njegova fluorescenca pada z naraščajočo povečavo. Zato je bolje opazovati materiale večjih vzorcev.
2. Fluorescenčni mikroskop v padajoči svetlobi je nov tip fluorescenčnega mikroskopa, razvit v sodobnem času. Za razliko od zgoraj navedenega vzbujevalna svetloba pade od leče objektiva navzdol na površino vzorca, pri čemer se uporablja ista leča objektiva kot osvetljevalni kondenzor in leča objektiva za zbiranje fluorescence. Optični poti je treba dodati dvobarvni razdelilnik žarka, ki je 45 stopinj oddaljen od svetlobnega urana. Pod kotom se vzbujevalna svetloba odbije v lečo objektiva in usmeri na vzorec. Fluorescenca, ki jo ustvari vzorec, ter vzbujevalna svetloba, ki se odbije od površine leče objektiva in pokrovnega stekla, vstopijo v lečo objektiva in se vrnejo v dvobarvni razdelilnik žarka, ki loči vzbujevalno svetlobo in fluorescenco. Preostalo vzbujevalno svetlobo nato absorbira blokirni filter. Če se uporabljajo različne kombinacije vzbujevalnih filtrov/dvobarvnih ločevalnikov žarkov/blokirnih filtrov, lahko zadostijo potrebam različnih fluorescentnih reakcijskih produktov. Prednosti tega fluorescenčnega mikroskopa so enakomerna osvetlitev polja, jasna slika in močnejša fluorescenca z večjo povečavo.
