Princip, značilnosti in uporaba fluorescenčnega mikroskopa
Načelo in strukturne značilnosti fluorescenčnega mikroskopa: fluorescenčni mikroskop uporablja točkovni vir svetlobe z visoko svetlobno učinkovitostjo za oddajanje določene valovne dolžine svetlobe (kot je ultravijolična svetloba 3650 in ali vijolično modra svetloba 4200 in) skozi sistem filtrov kot vzbujanje svetlobo za spodbujanje fluorescence v vzorcu. Ko snov oddaja fluorescenco različnih barv, jo opazujemo s povečavo leče objektiva in okularja. Na ta način ga je pod močnim kontrastnim ozadjem, tudi če je fluorescenca zelo šibka, enostavno prepoznati in ima visoko občutljivost. Uporablja se predvsem za raziskave celične strukture in delovanja ter kemične sestave. Osnovna zgradba fluorescenčnega mikroskopa je sestavljena iz običajnega optičnega mikroskopa in nekaterih dodatkov (kot so fluorescentni vir svetlobe, vzbujevalni filter, dvobarvni cepilnik žarka in blokirni filter itd.). Fluorescentni svetlobni vir – običajno uporabite ultravisokotlačno živosrebrno žarnico (50-200W), ki lahko oddaja svetlobo različnih valovnih dolžin, vendar ima vsaka fluorescentna snov vzbujevalno valovno dolžino, ki proizvaja najmočnejšo fluorescenco, zato vzbujevalni filter (na splošno, obstajajo ultravijolični, vijolični, modri in zeleni vzbujevalni filtri), ki prepuščajo samo vzbujevalni svetlobi določene valovne dolžine, da preide in obseva vzorec, medtem ko absorbira drugo svetlobo. Ko je vsaka snov obsevana z vzbujevalno svetlobo, oddaja vidno fluorescenco z daljšo valovno dolžino od valovne dolžine obsevanja v zelo kratkem času. Fluorescenca je specifična in na splošno šibkejša od vzbujalne svetlobe. Za opazovanje specifične fluorescence je za lečo objektiva potreben blokirni (ali dušilni) filter.
Ima dve funkciji: ena je absorbirati in blokirati vzbujevalno svetlobo pred vstopom v okular, da ne moti fluorescence in poškoduje oči; drugi je, da izberete in pustite, da določena fluorescenca prehaja skozi, kar kaže določeno fluorescentno barvo. Oba filtra je treba uporabljati skupaj.
Obstajata dve vrsti fluorescenčnih mikroskopov glede na njihove optične poti:
1. Transmisijski fluorescenčni mikroskop: vir vzbujanja svetlobe gre skozi material vzorca skozi zbiralno lečo, da vzbudi fluorescenco. Običajno se uporablja zbiralnik temnega polja, navaden zbiralnik pa se lahko uporablja tudi za nastavitev zrcala, tako da se vzbujevalna svetloba preusmeri in zaobide vzorcu. To je starejši fluorescentni mikroskop. Prednost je, da je fluorescenca močna pri majhni povečavi, slabost pa je, da se fluorescenca z večanjem povečave zmanjšuje. Zato je bolje opazovati materiale večjih vzorcev.
2. Epi-fluorescenčni mikroskop je nova vrsta fluorescenčnega mikroskopa, razvita v sodobnem času. Razlika je v tem, da vzbujevalna svetloba pada od leče objektiva navzdol na površino vzorca, to pomeni, da se ista leča objektiva uporablja kot osvetljevalni kondenzor in leča objektiva za zbiranje fluorescence. Na pot svetlobe je treba dodati dihroični razdelilnik žarka, ki je 45 stopinj stran od lahkega urana. Vzbujevalna svetloba se odbije v lečo objektiva in zbere na vzorcu. Fluorescenca, ki jo ustvari vzorec, in vzbujevalna svetloba, ki jo odbijeta površina leče leče objektiva in površina pokrovnega stekla, istočasno vstopita v lečo objektiva in se vrneta v dvobarvni razdelilnik žarka, da se vzbujevalna svetloba loči od fluorescence. , preostalo vzbujevalno svetlobo absorbirajo blokirni filtri. Kot na primer prehod na kombinacijo različnih vzbujevalnih filtrov/dvobarvnega razdelilnika žarkov/blokirnega filtra, lahko zadovolji potrebe različnih fluorescentnih reakcijskih produktov. Prednost tovrstnega fluorescenčnega mikroskopa je, da je osvetlitev vidnega polja enakomerna, slika jasna in večja kot je povečava, močnejša je fluorescenca.
Kako uporabljati fluorescenčni mikroskop
1. Vklopite vir svetlobe in ultravisokotlačna živosrebrna žarnica se mora segrevati nekaj minut, da doseže najsvetlejšo točko.
2. Transmisijski fluorescenčni mikroskop mora namestiti zahtevani vzbujevalni filter med svetlobni vir in kondenzor ter namestiti ustrezen blokirni filter za lečo objektiva. Epi-fluorescenčni mikroskopi morajo v reže na optični poti vstaviti zahtevani vzbujevalni filter/dvobarvni razdelilnik žarka/blokirni filter.
3. Opazujte z lečo z majhno povečavo in nastavite središče svetlobnega vira tako, da se nahaja v središču celotne svetlobne točke glede na nastavitveno napravo različnih modelov fluorescenčnih mikroskopov.
4. Postavite kos vzorca in opazujte po fokusiranju. Med uporabo bodite pozorni: ne opazujte neposredno s končnim filtrom, da ne poškodujete oči; pri opazovanju preparatov z oljno lečo morate uporabiti posebno oljno lečo brez fluorescence; po izklopu visokotlačne živosrebrne žarnice je ni mogoče takoj ponovno prižgati, zato jo je treba preizkusiti. Ponovno jo lahko zaženete po 5 minutah, sicer bo nestabilna in bo vplivala na življenjsko dobo živosrebrne sijalke.
