Razlika med (dvofotonskim, konfokalnim) fluorescenčnim mikroskopom in navadnim mikroskopom
Osnovno načelo dvofotonskega vzbujanja je, da lahko fluorescentne molekule pri visoki gostoti fotona hkrati absorbirajo dva fotona dolge valovne dolžine in oddajajo krajši foton valovne dolžine po kratkem obdobju tako imenovanega življenjskega stanja; Učinek je enak kot uporaba fotona s polovico valovne dolžine dolge valovne dolžine za vzbujanje fluorescentnih molekul. Dva fotona vzbujata potrebna visoka gostota fotona, da se izognemo poškodovanim celicam, dvofotonska mikroskopija uporablja visokoenergijske impulzne laserje. Laser, ki ga oddaja ta laser, ima visoko največjo energijo in nizko povprečno energijo, s širino impulza le 100 femtosekund in frekvenco do 80 do 100 megahertov. Pri uporabi visoke številčne objektivne zaslonke za osredotočanje fotonov impulznega laserja je gostota fotona na žariščni točki objektivne leče najvišja, dvofotonska vzbujanje pa se pojavi le na žariščni točki objektivne leče. Zato dvofotonski mikroskop ne potrebuje konfokalne luknje, kar izboljša učinkovitost odkrivanja fluorescence.
Na splošno lahko fluorescenčna pojava zaradi nizke gostote fotona vzbujevalne svetlobe fluorescentna molekula naenkrat absorbira samo en foton in nato oddaja še en fluorescenčni foton skozi sevalni prehod, ki je znan kot enoto foorescenca. Za procese vzbujanja fluorescence, ki uporabljajo laserje kot svetlobne vire, se lahko pojavijo dvofotonski ali celo večfotonski fluorescenčni pojavi. V tem primeru ima uporabljeni vir vzbujanja svetlobe visoko intenzivnost in gostoto fotona, ki ustreza zahtevam po fluorescentnih molekulah, da hkrati absorbirajo dva fotona. V procesu uporabe splošnega laserja kot vira vzbujanja svetlobe je gostota fotona še vedno nezadostna za proizvodnjo dvofotonskega absorpcijskega pojava. Običajno se uporabljajo femtosekundni impulzni laserji, s takojšnjo močjo, ki doseže raven megavata. Zato je valovna dolžina dvofotonske fluorescence krajša kot pri vzbujanju svetlobe, ki je enakovredna učinku, ki nastane s polovico vzbujanja valovne dolžine vzbujanja.
Znanje, povezano s konfokalno fluorescentno mikroskopijo
Osnovno načelo konfokalne fluorescenčne mikroskopije je uporaba točkovnega vira svetlobe za obsevanje vzorca, ki tvori dobro opredeljeno majhno svetlobo na goriščni ravnini. Fluorescenco, ki se oddaja s tega mesta po obsevanju, zbira objektivna leča in pošlje nazaj po prvotni poti obsevanja do cepila žarka, sestavljenega iz dihroičnega ogledala. Spektrometer pošlje fluorescenco neposredno detektorju. Pred svetlobnim virom in detektorjem je luknja, ki se imenuje osvetlitvena luknja in luknja za zaznavanje. Geometrijske dimenzije obeh so dosledne, približno 100-200 nm; V primerjavi s svetlobno točko na goriščni ravnini sta dva konjugata, kar pomeni, da svetlobna točka prehaja skozi vrsto leč in se lahko na koncu osredotoči tako na osvetlitveno luknjo kot na luknjo za odkrivanje hkrati. Na ta način se lahko svetloba iz goriščne ravnine zbliža v območju luknje za zaznavanje, medtem ko je razpršena svetloba od zgoraj ali pod goriščno ravnino blokirana zunaj luknje za zaznavanje in je ni mogoče slikati. Skeniranje vzorčne točke po točki z laserjem, cev za fotomultiplikacijo po zaznavanju luknje dobi tudi ustrezno konfokalno sliko svetlobne točke, jo pretvori v digitalni signal in jo prenese v računalnik in jo na koncu združi v bistro konfokalno sliko celotne žariščne ravnine na zaslonu.
