Tehnične lastnosti in veščine uporabe dvofotonskega fluorescenčnega mikroskopa
Dvofotonska fluorescenčna mikroskopija je nova tehnologija, ki združuje konfokalno mikroskopijo z laserskim skeniranjem in tehnologijo dvofotonskega vzbujanja.
Osnovno načelo dvofotonskega vzbujanja je: v primeru visoke gostote fotonov lahko fluorescentne molekule absorbirajo dva fotona z dolgo valovno dolžino hkrati in oddajo foton s krajšo valovno dolžino po kratkem obdobju tako imenovane življenjske dobe v vzbujenem stanju. . ; Učinek je enak, kot če bi uporabili foton z valovno dolžino, ki je polovica dolge valovne dolžine, da bi vzbudili fluorescentno molekulo. Dvofotonsko vzbujanje zahteva visoko gostoto fotonov. Da ne bi poškodovali celic, dvofotonska mikroskopija uporablja visokoenergijske impulzne laserje z zaklenjenim načinom. Laser, ki ga oddaja ta laser, ima visoko temensko energijo in nizko povprečno energijo, njegova impulzna širina je samo 100 femtosekund, njegova doba pa lahko doseže 80 do 100 megahercev. Pri uporabi leče objektiva z visoko numerično odprtino za fokusiranje fotonov impulznega laserja je gostota fotonov v gorišču leče objektiva največja, dvofotonsko vzbujanje pa se pojavi samo v gorišču leče objektiva, tako da dvofotonski mikroskop ne potrebuje konfokalne luknjice, kar izboljša učinkovitost zaznavanja fluorescence. Je pomembna raziskovalna metoda na področjih morfologije, molekularne celične biologije, nevroznanosti in farmakologije.
1. Ozadje nastanka dvofotonske mikroskopije - dve omejitvi tradicionalne laserske konfokalne mikroskopije:
1) Eden je pojav fototoksičnosti: ker mora biti konfokalna luknjica dovolj majhna, da dobi sliko visoke ločljivosti, majhna odprtina pa bo blokirala velik del fluorescence, ki jo oddaja vzorec, vključno s fluorescenco, ki jo oddaja goriščna ravnina, ustrezen Da, vzbujalna svetloba mora biti dovolj močna, da se doseže zadostno razmerje med signalom in šumom; in visokointenzivni laser bo povzročil, da bo fluorescentno barvilo med neprekinjenim skeniranjem hitro zbledelo, fluorescentni signal pa bo z napredovanjem skeniranja postajal vedno šibkejši.
2) Fototoksičnost je še en problem. Pod laserskim obsevanjem bodo številne molekule fluorescentnega barvila proizvedle citotoksine, kot so singletni kisik ali prosti radikali, zato morata biti čas skeniranja in gostota optične moči vzbujevalne svetlobe v poskusu omejena, da se ohrani gostota vzorca. aktivna. Pri raziskavah na aktivnih vzorcih, zlasti različnih stopnjah rasti in razvoja aktivnih vzorcev, fotobeljenje in fototoksičnost zelo omejujejo te študije.
2. Zakaj pravite, da dvofotonskih mikroskopov na splošno ni treba opremiti z ultravijoličnimi vzbujevalnimi laserji?
Dvofotonska mikroskopija je tehnologija vzbujanja fluorescence, ki temelji na učinku dvofotonskega vzbujanja: molekule fluorescentnega barvila je mogoče vzbuditi z absorbiranjem dveh nizkoenergijskih fotonov hkrati (časovni interval med dvema fotonoma, ki dosežeta fluorescentne molekule, je krajši od 1 femtosekunde ), njegov učinek vzbujanja je lahko enakovreden absorpciji visokoenergetskega fotona 1/2 valovne dolžine. Na primer, absorbcija dveh fotonov pri rdečih valovnih dolžinah je enakovredna molekuli, ki absorbira ultravijolično. Celice ne absorbirajo zlahka fotonov dolgih valovnih dolžin, zato se zmanjša fototoksičnost za žive celice, zmanjša pa se tudi fotobeljenje. Na ta način ne igra le funkcije ultravijoličnega vzbujanja, temveč se tudi izogne poškodbam vzorca zaradi ultravijolične svetlobe.
3. Kakšna je posebnost laserja dvofotonskega mikroskopa?
Verjetnost dvofotonske absorpcije je odvisna od tega, kako natančno sovpadata dva vpadna fotona v prostoru in času (fotona morata prispeti v 10-18 sekundah). Dvofotonski absorpcijski presek je majhen in vzbujajo se le fluoroforji v območjih z velikim pretokom fotonov. Zato je večina uporabljenih laserjev s titanovim safirjem, ki lahko dosežejo pikosekundne ali femtosekundne hitrosti skeniranja ter imajo zelo visoko konično moč in nizko povprečno moč, tako da je mogoče fotobeljenje in fototoksičnost zmanjšati ali odpraviti. Najpomembneje je zagotoviti zelo visoko gostoto fotonov v majhnem območju, ki lahko zagotovi hkratno vzbujanje dveh fotonov.
4. Kakšne so prednosti dvofotonskega vzbujanja?
1) Povečajte selektivnost barvila: območje vzbujalne svetlobe laserja konfokalnega sistema (Ar, Ar/Kr, HeNe) je 488 nm - 647 nm. To pomeni eksperimentiranje z UV-vzbujenimi fluorescenčnimi barvili, npr. z DAPI, Hoescht. Vzbujevalna valovna dolžina dvofotona je dvakrat večja od valovne dolžine enofotona, zato lahko barve, ki jih vzbuja ultravijolično, vzbuja skoraj infrardeča svetloba.
2) Zmanjšajte fotobeljenje: zaradi zmanjšanja fotobeljenja se stopnja uspešnosti poskusov z uporabo CFP/YFP za fluorescenčni resonančni prenos energije (FRET) poveča.
3) Posebna objektivna leča ni potrebna: z vidika strojne opreme vzbujanje UV-vzbujenih barvil z valovno dolžino bližnje infrardeče svetlobe ne zahteva posebnih UV-optičnih komponent.
4) Izboljšajte razmerje med signalom in šumom: valovna dolžina vzbujalne svetlobe in valovna dolžina oddane svetlobe imata veliko razliko, kar izboljša razmerje med signalom in šumom.
5) Beljenje, lokalizirano na žariščno točko: Ker se vzbujanje fluorescence pojavi samo na žariščni točki objektiva, ni potrebe po konfokalni luknjici. To izboljša zaznavanje svetlobe in fotobeljenje se pojavi le v žariščni točki.
6) Lažje prodre v vzorce: Infrardeča svetloba valovne dolžine se v celicah ne razprši zlahka in lahko prodre v globlje vzorce.
5. Kaj je največja izboljšava dvofotonske mikroskopije v primerjavi z lasersko skenirajočo konfokalno mikroskopijo?
1) Zmanjšano fotobeljenje.
2) Zmanjšana fototoksičnost.
3) Ni ga enostavno razpršiti in lažje je prodreti v debele vzorce, kot so rezine možganov.
