Tehnike barvanja in mikroskopsko opazovanje mikroorganizmov
Enostavno barvanje bakterij
1 Cilji
1.1 Naučiti se osnovnih tehnik mikrobnega brisa in barvanja.
1.2 Obvladati preprosto metodo barvanja bakterij.
1.3 Spoznati morfološke značilnosti bakterij ter utrditi naučenost uporabe oljnega ogledala in tehnike aseptičnega delovanja.
2 Princip Razmaz in barvanje bakterij je osnovna tehnika v mikrobioloških poskusih. Celice bakterij so majhne in prozorne, pod običajnim svetlobnim mikroskopom jih ni lahko prepoznati, zato jih je treba obarvati. Uporaba enega samega barvila za barvanje bakterij, tako da obarvani organizem in ozadje tvorita jasno barvno razliko, tako da je mogoče jasneje opaziti njihovo morfologijo in strukturo. Ta metoda je enostavna za izvedbo in primerna za opazovanje splošne oblike organizma in razporeditve bakterij. Alkalna barvila se običajno uporabljajo za preprosto barvanje, ker so v nevtralnih, alkalnih ali šibko kislih raztopinah bakterijske celice običajno negativno nabite, in ko so alkalna barvila ionizirana, je barvni del njihovih molekul pozitivno nabit, tako da je barvni del alkalnih barvil se zlahka veže na bakterije, da se bakterije obarvajo. Obarvane bakterijske celice so v ostrem kontrastu z ozadjem in jih je lažje prepoznati pod mikroskopom. Običajno uporabljena barvila za preprosto obarvanje vključujejo merosianin modro, kristalno vijolično in bazično spojino rdeče. Ko bakterijska razgradnja sladkorja proizvede kislino, tako da se pH medija zmanjša, se pozitivni naboj bakterij poveča, nato pa se lahko uporablja v rdečem, kislem rdečem ali kongo rdečem in drugih kislih barvilih. Pred obarvanjem je treba bakterije fiksirati. Njegov namen je dvojen: prvi je uničiti bakterije in omogočiti, da se bakterije prilepijo na stekelce; drugi je povečati njegovo afiniteto za barvilo. Običajno se uporabljata dve metodi: segrevanje in kemična fiksacija. Pri fiksiranju poskušajte ohraniti prvotno morfologijo celic.
3 Materiali
3.1 Sev Bacillus subtilis 12-18h hranilna poševna kultura na agarju, Staphylococcus aureus približno 24-urna hranilna poševna kultura na agarju, Escherichia coli 24-urna hranilna poševna kultura na agarju, pekovski kvas poševna kultura na agarju.
3.2 Barvanje Luejev alkalni metilensko modri madež (ali kristalno vijolično barvanje z amonijevim oksalatom), rdeči madež spojine karbolne kisline.
3.3 Instrumenti ali drugi pripomočki Mikroskop, alkoholna svetilka, objektno stekelce, inokulacijski obroč, držalo za objektno stekelce, dvoslojna steklenička (napolnjena s cedrovim oljem in ksilenom), mikroskopski papir, fiziološka raztopina ali destilirana voda itd.
4 Postopek Bris → sušenje → fiksacija → barvanje → pranje → sušenje → mikroskopski pregled.
5 korakov
5.1 bris Vzemite dve čisti stekelci brez olja, vsako z majhno kapljico fiziološke raztopine (ali destilirane vode) na sredini stekelca v aseptičnih pogojih, z inokulacijskim obročem za aseptično delovanje Bacillus subtilis, Garcinia micrococcus in Escherichia coli poševno, da izberejo malo mahu v kapljici vode, premešajo in prekrijejo s filmom. Če bakterijsko suspenzijo (ali tekočo kulturo) razmažete, lahko uporabite za inokulacijo 2 do 3 obročkov izbirnika prstanov neposredno na stekelce. Upoštevajte, da fiziološke raztopine (destilirane vode) in vzemite bakterije ne sme biti preveč in enakomerno porazdeljeno, ne predebelo.
5.2 Sušenje Sušite naravno pri sobni temperaturi. Lahko se posuši tudi tako, da se rahlo segreje nad alkoholno svetilko s premazano stranjo navzgor. Vendar se ognju ne približujte preveč, saj bo previsoka temperatura uničila morfologijo bakterij.
5.3 Fiksiranje Če se uporablja toplotno sušenje, se fiksiranje in sušenje združita v en sam korak na enak način kot sušenje. Razmažite, posušite in toplotno fiksirajte.
5.4 Barvanje Stekelec postavite ravno na polico za stekelca, na razmaz dodajte 1 do 2 kapljici raztopine za barvanje (primerna je raztopina za barvanje, ki samo prekrije film za razmaz). Barvajte razmaz z Lü's Basic Mellanox Blue 1~2 minuti in s karbonatnim rdečim (ali amonijevim oksalat kristalno vijoličnim) približno 1 minuto.
5.5 Izpiranje Odlijte raztopino za barvanje in nežno izpirajte z vodo iz pipe z enega konca stekelca, dokler voda, ki teče iz razmaza, ni brezbarvna. Pri izpiranju ne pustite, da voda teče neposredno za pranje premazane površine. Pretok vode ne sme biti prehiter ali prevelik, da preprečite odstranitev razmaznega filma.
5.6 Sušenje Otresite vodne kapljice na stekelcu, da se naravno posušijo, posušite s fenom ali uporabite vpojni papir, da vpijete suho (pazite, da ne obrišete telesa bakterije). 5.7 Mikroskopski pregled Bris posušimo in pregledamo pod mikroskopom. Razmaz mora biti popolnoma suh, preden ga lahko opazujemo z oljnim mikroskopom.
6 Rezultati Narišite morfologijo E. coli in Micrococcus garciniae po enkratnem barvanju.
Madež po Gramu
1 Namen
1.1 Razumeti princip barvanja po Gramu in njegov pomen pri razvrščanju in identifikaciji bakterij.
1.2 Naučiti se in osvojiti tehniko barvanja po Gramu ter utrditi naučeno uporabo oljne leče svetlobnega mikroskopa.
