Premikanje meja mikroskopije visoke ločljivosti: mikroskopija s samoporavnavo
Izjemno natančna mikroskopija, ki presega omejitve mikroskopa visoke ločljivosti, ki je prejel Nobelovo nagrado, bo znanstvenikom omogočila neposredno merjenje razdalj med posameznimi molekulami.
Medicinski raziskovalci na Univerzi v Novem Južnem Walesu so dosegli ločljivost brez primere v mikroskopiji ene molekule za odkrivanje interakcij med posameznimi molekulami znotraj nedotaknjenih celic.
Nobelova nagrada za kemijo leta 2014 je bila podeljena za razvoj tehnologije fluorescenčne mikroskopije z visoko ločljivostjo, ki je mikroskopistom omogočila prvi molekularni pogled na notranjost celice, funkcijo, ki omogoča nove molekularne poglede na kompleksne biološke sisteme in procese.
Zdaj so bile meje zaznavanja mikroskopije ene molekule ponovno premaknjene, podrobnosti pa so bile objavljene v zadnji številki Science Advances.
Posamezne molekule je bilo mogoče opazovati in slediti z mikroskopi ultra visoke ločljivosti, vendar se interakcije med temi molekulami pojavljajo v obsegu, ki je vsaj štirikrat manjši od tistega, ki ga razločijo obstoječi enomolekulski mikroskopi.
"Razlog, zakaj imajo mikroskopi z eno molekulo običajno lokalizacijsko natančnost okoli 20 do 30 nanometrov, je običajno ta, da se mikroskop dejansko premika, ko zaznava signale. To vodi v negotovost. Z uporabo obstoječih instrumentov za super ločljivost ne moremo ugotoviti, ali je en protein vezan na drugi zato, ker je razdalja med njimi krajša od negotovosti v njihovih položajih."
Da bi rešili to težavo, je ekipa zgradila avtomatizirano povratno zanko znotraj enomolekulskega mikroskopa, ki zazna in ponovno poravna optično pot in zrcalno stopnjo.
"Ni pomembno, kaj počnete s tem mikroskopom, v bistvu najde povratno pot z nanometrsko natančnostjo. Je pameten mikroskop. Lahko naredi vse, kar mora storiti operater ali servisni inženir, in to lahko stori 12-krat na sekundo. " Prof. Goss je rekel.
Merjenje razdalje med proteini
Z zasnovo in metodologijo, opisano v tem dokumentu, je ekipa UNSW oblikovala povratni sistem, ki je združljiv z obstoječimi mikroskopi in zagotavlja največjo prilagodljivost za pripravo vzorcev.
"To je zelo preprosta in elegantna rešitev za velik problem slikanja. Pravkar smo zgradili mikroskop znotraj mikroskopa in vse, kar smo naredili, je bilo poravnati glavni mikroskop. Enostavnost in praktičnost rešitve, ki smo jo našli, je njena resnična moč. Enostavno je klonirati sistem in hitro sprejeti nove tehnologije." Prof. Goss je rekel.
Da bi dokazali uporabnost njegovega ultra-natančnega enomolekulskega mikroskopa s povratnimi informacijami, so ga raziskovalci uporabili za neposredne meritve razdalje med signalizirajočimi proteini v celicah T. Pogosta predpostavka v celični imunologiji je, da te imunske celice ostanejo v mirovanju, ko je receptor T-celice blizu druge molekule, ki deluje kot zavora.
Njihova visokonatančna mikroskopija je lahko pokazala, da sta bili dve signalni molekuli dejansko še bolj ločeni druga od druge v aktiviranih celicah T, pri čemer se je sprostila zavora in vklopila signalizacija T-celičnega receptorja.
Prof. Goss je dejal: "Konvencionalne mikroskopske tehnike ne bi mogle natančno izmeriti tako majhne spremembe, ker se razdalja med temi signalnimi molekulami v mirujočih in aktiviranih celicah T razlikuje le za 4-7 nanometrov."
"To tudi kaže, kako občutljivi so ti signalni mehanizmi na prostorsko izolacijo. Za identifikacijo takšnih regulativnih procesov moramo opraviti natančne meritve razdalje, kar omogoča ta mikroskop. Ti rezultati kažejo, da je tehnologija v odkritju in je ni mogoče proizvesti v nobenem druga smer."
