Načela laserske konfokalne mikroskopije (LSCM)
Laserski konfokalni mikroskop uporablja luknjico za osvetljevanje, nameščeno za virom svetlobe, in luknjico za zaznavanje, nameščeno pred detektorjem, da doseže točkovno osvetlitev in zaznavanje točk. Svetloba iz svetlobnega vira je fokusirana na točko v goriščni ravnini vzorca s svetlobo, ki jo oddaja skozi luknjico za osvetljevanje, fluorescenca, ki se oddaja iz te točke, pa je prikazana znotraj luknje za zaznavanje, vsa oddana svetloba zunaj te točke pa je blokirana z luknja za odkrivanje. Luknjica za osvetlitev in luknjica za zaznavanje sta konjugirani za osvetljeno ali zaznano točko, tako da je zaznana točka konfokalna točka, ravnina, kjer se zaznana točka nahaja, pa konfokalna ravnina. Računalnik prikaže zaznano točko na računalniškem zaslonu v obliki slikovne točke. Za izdelavo celotne slike sistem za skeniranje v optični poti skenira goriščno ravnino vzorca in tako ustvari popolno konfokalno sliko. Dokler se nosilec premika gor in dol vzdolž osi Z, se nova raven vzorca premakne na konfokalno ravnino in nova raven vzorca se prikaže na monitorju, ko se os Z nadaljuje premikanje, dobimo zaporedne svetlobno izrezane slike različnih nivojev vzorca.
Tradicionalni optični mikroskop uporablja poljski svetlobni vir; slika vsake točke na vzorcu bo motena zaradi uklona ali sipanja svetlobe iz sosednjih točk; laserski skenirni konfokalni mikroskop uporablja laserski žarek skozi osvetljeno luknjico za oblikovanje točkovnega vira svetlobe na vzorcu, skeniranem na vsaki točki notranje goriščne ravnine, vzorcu na obsevani točki, slikanje detekcijske luknjice, z zaznavanjem luknjice po množilni cevi za točko svetlobe (PMT) ali napravi s hladnim elektrosklopom (cCCD). Na zaslonu računalniškega monitorja se hitro oblikuje fluorescenčna slika, sprejeta od točke do točke ali vrstice za vrstico. Luknjica za osvetljevanje in luknja za zaznavanje glede na goriščno ravnino leče objektiva je konjugirana, točka na goriščni ravnini je hkrati osredotočena na luknjo za osvetlitev in luknjico za oddajanje, točka zunaj goriščne ravnine ne bo pri zaznavanju luknjico na slikanju, tako da je dobljena konfokalna slika optični prerez vzorca, s čimer se odpravijo pomanjkljivosti meglene slike običajnega mikroskopa.
Iz osnovnega principa je laserski konfokalni mikroskop sodoben optični mikroskop, navaden svetlobni mikroskop iz tehnologije, ki omogoča naslednje izboljšave.
1. Uporabite laser kot vir svetlobe, ker je monokromatičnost laserja zelo dobra, valovna dolžina žarka svetlobnega vira je enaka, kar v bistvu odpravi kromatsko aberacijo.
2. Uporaba konfokalne tehnologije v goriščni ravnini leče objektiva, nameščene na sredini z majhno luknjo v pregradi, goriščna ravnina zunaj blokiranja razpršene svetlobe, odpravlja sferično aberacijo; in dodatno odpraviti kromatsko aberacijo.
3. Laserski konfokalni mikroskop, ki uporablja tehnologijo točkovnega skeniranja za razgradnjo vzorca v dvodimenzionalni ali tridimenzionalni prostor na nešteto točk, z zelo majhnim laserskim žarkom (točkovni svetlobni vir) skeniranje od točke do točke, črto za črto in nato skozi mikroračunalniška kombinacija celotne ravnine ali tridimenzionalne slike. Tradicionalni svetlobni mikroskop je poljski vir svetlobe pod enkratnim slikanjem, vzorci na vsaki točki slike bodo ob točki difraktirane svetlobe in motenj razpršene svetlobe. Jasnosti in natančnosti teh dveh slik ni mogoče primerjati.
4. Zajem in obdelava optičnih signalov z računalnikom ter ojačanje signalov s fotopomnoževalno cevjo
Pri laserskem konfokalnem mikroskopu računalnik nadomesti človeško oko ali kamero za opazovanje in video snemanje, dobljene slike pa so digitalizirane in jih je mogoče obdelati v računalniku, da ponovno izboljšajo jasnost slik. Poleg tega lahko uporaba fotopomnoževalnih cevi ojača zelo šibke signale, kar močno izboljša občutljivost. Zaradi kombinirane uporabe zgornjih tehnologij lahko rečemo, da je LSCM najnaprednejši mikroskop na svetu. Lahko rečemo, da je LSCM kombinacija proizvodne tehnologije mikroskopa, fotoelektrične tehnologije, računalniške tehnologije **, neizogiben produkt razvoja sodobne tehnologije.
