Princip in konstrukcija fluorescenčnega mikroskopa
Fluorescenčni mikroskop uporablja točkovni vir svetlobe z visoko svetlobno učinkovitostjo, ki oddaja določeno valovno dolžino svetlobe (kot je ultravijolična svetloba 3650 in vijolično modra svetloba 4200 in) skozi sistem barvnega filtra kot vzbujevalno svetlobo in vzbudi fluorescentne snovi v vzorcu, da oddajajo različne barve fluorescence. Nato ga opazujemo s povečavo objektiva in okularja. Na ta način je tudi pri šibki fluorescenci zlahka prepoznaven in zelo občutljiv pod močnimi kontrastnimi ozadji, ki se uporablja predvsem za preučevanje celične strukture in delovanja ter kemične sestave. Osnovna zgradba fluorescenčnega mikroskopa je sestavljena iz običajnega optičnega mikroskopa in nekaterih dodatkov (kot so fluorescentni vir svetlobe, vzbujevalni filter, bikromatski ločevalnik žarkov in blokirni filter itd.). Fluorescentni viri svetlobe - običajno uporabljajo ultravisokotlačne živosrebrne sijalke (50-200W), ki lahko oddajajo svetlobo različnih valovnih dolžin. Vendar pa ima vsaka fluorescentna snov valovno dolžino vzbujevalne svetlobe, ki proizvaja najmočnejšo fluorescenco, zato je treba dodati vzbujevalne filtre (običajno ultravijolične, vijolične, modre in zelene vzbujevalne filtre), ki omogočijo samo določeni valovni dolžini vzbujevalne svetlobe, da preide in osvetli vzorec, medtem ko absorbira vso ostalo svetlobo. Po obsevanju z vzbujeno svetlobo vsaka snov v zelo kratkem času oddaja vidno fluorescenco z daljšo valovno dolžino kot obsevanje. Fluorescenca je specifična in je na splošno šibkejša od vzbujalne svetlobe. Za opazovanje specifične fluorescence je treba za lečo objektiva dodati blokirni (ali dušilni) filter. Ima dve funkciji: prvič, absorbira in blokira vzbujajočo svetlobo pred vstopom v okular, da prepreči motenje fluorescence in poškodbe oči; drugič, izbere in dovoli določeni fluorescenci, da preide, tako da prikaže določeno barvo fluorescence. Za skupno uporabo je treba izbrati obe vrsti filtrov.
Obstajata dve vrsti fluorescenčnih mikroskopov glede na njihovo optično pot:
1. Transmisijski fluorescenčni mikroskop: Vzbujevalni svetlobni vir se prenaša skozi material vzorca skozi kondenzator, da vzbudi fluorescenco. Običajno uporabljeni zbiralniki svetlobe temnega polja ali običajni zbiralniki svetlobe se lahko uporabljajo za prilagoditev reflektorja za pretvorbo vzbujevalne in stranske svetlobe na vzorec. To je razmeroma staromoden fluorescenčni mikroskop. Njegova prednost je v tem, da je fluorescenca močna pri majhni povečavi, slabost pa v tem, da z večanjem povečave fluorescenca slabi. Zato je bolje opazovati materiale večjih vzorcev.
2. Fluorescenčni mikroskop s padajočim žarkom To je nov tip fluorescenčnega mikroskopa, razvit v sodobnem času. Za razliko od prejšnjega, vzbujevalna svetloba pade navzdol od leče objektiva na površino vzorca, pri čemer se uporablja ista leča objektiva kot osvetljevalni kondenzor in leča objektiva za zbiranje fluorescence. Optični poti, ki je pod kotom 45 stopinj glede na lahki uran, je treba dodati dvobarvni separator žarkov. Vzbujevalna svetloba se odbije v lečo objektiva in koncentrira na vzorec. Fluorescenca, ki jo ustvari vzorec, kot tudi vzbujevalna svetloba, ki se odbije od površine leče objektiva in pokrovnega stekla, istočasno vstopita v lečo objektiva in se vrneta v dihroični separator žarkov, ki ločujeta vzbujanje in fluorescenco. Preostalo vzbujanje nato absorbira blokirni filter. Če se uporabljajo različni vzbujevalni filtri/dvobarvni ločevalniki žarkov/kombinacije blokirnih filtrov, lahko zadostijo potrebam različnih fluorescentnih reakcijskih produktov. Prednost tega fluorescentnega mikroskopa je, da je osvetlitev vidnega polja enakomerna, slika jasna in večja kot je povečava, močnejša je fluorescenca.
