Priprava in opazovanje bioloških vzorcev za elektronsko mikroskopijo
Ločljivost mikroskopa je odvisna od valovne dolžine uporabljene svetlobe. Elektronski mikroskop, ki se je začel pojavljati leta 1933, kot vir svetlobe uporablja elektronski žarek z valovno dolžino, ki je veliko krajša od valovne dolžine vidne svetlobe, tako da je ločljivost, ki jo lahko doseže, v primerjavi z optičnim mikroskopom močno izboljšana. Razlika v virih svetlobe določa tudi vrsto razlik med elektronskimi mikroskopi in optičnimi mikroskopi.
Glede na razlike v principih slikanja z elektronskim žarkom in različne načine delovanja na vzorce, so se sodobni elektronski mikroskopi razvili v več vrst. Trenutno se najpogosteje uporabljajo transmisijski elektronski mikroskopi in vrstični elektronski mikroskopi. Skupna povečava prvega je lahko med 1000-1000000. Skupna povečava slednjega se lahko giblje med 20 in 300,000-krat. Ta poskus v glavnem predstavlja pripravo dveh vrst vzorcev mikroskopa, transmisijskega elektronskega mikroskopa in vrstičnega elektronskega mikroskopa.
2. Oprema
1. Bakterija Escherichia coli (Escherichia coli) poševno.
2. Raztopina ali reagent amil acetat, koncentrirana žveplova kislina, absolutni etanol, sterilna voda, 2 % vodna raztopina natrijevega fosfovolframata (pH 6.5-8.0), 0.3% polietilen formaldehid (topen v kloroformu) raztopina, celice Pigment c, amonijev acetat, plazmid pBR322.
3. Instrumenti ali drugi pripomočki: navaden optični mikroskop, bakrena mrežica, porcelanasti lijak, čaša, posodica, sterilna kapalka, sterilna pinceta, bucike, predmetna stekelca, števna plošča, vakuumski premazni stroj, sušilnik za kritične točke itd.
3. Koraki delovanja
(1) Priprava vzorca in opazovanje za transmisijsko elektronsko mikroskopijo
1. Obdelava kovinske mreže
Vzorec za optično mikroskopijo postavimo na objektno stekelce za opazovanje. Ker pa elektroni ne morejo prodreti skozi stekleno ploščo, se v transmisijski elektronski mikroskopiji lahko uporabijo le mrežasti materiali kot nosilci, ki se običajno imenujejo nosilne mreže. Nosilno mrežo lahko zaradi različnih materialov in oblik razdelimo na veliko različnih specifikacij, med katerimi je najpogosteje uporabljena 200-400 mreža (število lukenj) bakrena mreža. Bakreno mrežo je treba pred uporabo obdelati, da odstranite umazanijo in jo ohranite čisto, sicer bo to vplivalo na kakovost nosilne folije in jasnost fotografij vzorcev. Ta poskus uporablja 400-mrežasto bakreno mrežico, ki jo je mogoče obdelati na naslednji način: najprej jo nekaj ur namočite in belite z amil acetatom, nato jo večkrat sperite z destilirano vodo in nato namočite v absolutni etanol za dehidracija. Če bakrena mrežica po zgornjih metodah še vedno ni čista, jo lahko za 1 do 2 minuti namočite v razredčeno koncentrirano žveplovo kislino (1:1) ali pa jo nekaj minut prekuhajte v 1 % raztopini NaOH, sperite z destilirano večkrat vodo, nato pa jo dajte v brezvodno dehidrirajte v etanolu in odstavite.
2. Priprava podporne membrane
Pri opazovanju vzorcev mora biti tudi nosilna mreža prekrita s plastjo nestrukturirane, enotne folije, sicer bodo majhni vzorci uhajali iz lukenj nosilne mreže. Ta film se običajno imenuje nosilni film ali nosilni film. Nosilna folija mora biti elektronsko prosojna, njena debelina pa mora biti na splošno manjša od 20 nm; pod vplivom elektronskega žarka mora imeti film tudi določeno mehansko trdnost, da ohrani strukturno stabilnost in dobro toplotno prevodnost; poleg tega je treba podporno mrežo uporabiti pri elektronski mikroskopiji. Spodaj ne sme biti nobene vidne strukture, nobene kemične reakcije z vzorcem, ki se prenaša, in nobenih motenj pri opazovanju vzorca. Njegova debelina je običajno približno 15 nm. Nosilna folija je lahko plastična folija (kot je kolodijska folija, polietilen formaldehidna folija itd.), Ogljikova folija ali kovinska folija (kot je berilijev film itd.). V normalnih delovnih pogojih lahko plastična folija izpolnjuje zahteve. Med plastičnimi folijami je kolodijev film razmeroma enostaven za pripravo, vendar njegova trdnost ni tako dobra kot polietilenformaldehidni film.
