Zahteve za debelino optičnega mikroskopa za stekelca
Mikroskopska dehidracija in pritrditev vzorca: zaradi ponavljajočega se centrifugiranja celice izgubijo, zato je najbolje celice pritrditi na površino stekelca ali plastične plošče za optično mikroskopijo, da se celice dehidrirajo in posušijo skupaj s steklom. diapozitiv ali plastična folija. Zahteve glede debeline stekelcev v optični mikroskopiji Da bi se celice lahko pritrdile na stekelca ali plastične plošče, je treba na stekelca ali plastične plošče najprej položiti plast filma. Način polaganja filma je naslednji:
(1) Najenostavnejša metoda za optično mikroskopijo je polaganje tanke plasti polivinil formalnega (formvar) filma. Očiščena stekelca namočite v (0.5-1) odstotno raztopino polivinil formalnega kloroforma. Ko se atmosfera izhlapi, se na diapozitivih pojavi bel film. Stekelca večkrat pretresite v kloroformu, da se film spremeni. Tanek in pripravljen za uporabo.
(2) Na očiščeno stekelce kapnite 0.1 latitude poli-L-lizin (med pripravo raztopite 1 mg polilizina v 1 ml filtrirane vode) in ga položite v škatlo za dovod 450C, ko se kapljica razpre . suho. Ta metoda je najboljša, ker je poli-L-lizin pozitivno nabit, kar omogoča pritrditev več površinsko negativno nabitih celic.
(3) Destilirani vodi dodajte plazmo in glicerol v razmerju (30--40) odstotkov in (3-5) odstotkov v skladu z zahtevami optičnega mikroskopa za debelino stekelca, da nastane glicerolski protein rešitev. Tekočino kapnemo na očiščeno stekelce, razgrnemo in posušimo pod optičnim mikroskopom. Položen proteinski film se potopi v 2-odstotni glutaraldehid, da se protein fiksira, opere in posuši za kasnejšo uporabo. Pred uporabo plazmo kapnemo na proteinski film. Naredimo ga "aktiviranega", po 30 minutah speremo s pufrom in ga lahko neposredno nanesemo.
Iz fiksiranih in očiščenih celic naredimo ustrezno koncentracijo celične suspenzije s filtrirano vodo pod digitalnim mikroskopom, optični mikroskop pa postavimo na predmetno stekelce ali plastično folijo, ki je prekrita z membrano, in postavimo v vlažno, nizko temperatura (40C) okolje (30-120) minut, da se celice lahko pritrdijo na membrano. S tanko pinceto vzemite predmetno stekelce in ga stresite v čisto dvojno destilirano vodo ter z optičnim mikroskopom sperite nepritrjene celice. Zahteve glede debeline stekelcev v optičnih mikroskopih Polarizacijske mikroskope nato hitro postavimo v posodo, napolnjeno s 50-odstotnim acetonom (ali etanolom). Postopek dehidracije je, da stekelca damo v aceton ali etanol z naraščajočo koncentracijo vsake 3 minute in z optičnim mikroskopom ali nenehno povečujemo koncentracijo dehidracijskega sredstva v posodi za stekelca. Po avtorjevih laboratorijskih izkušnjah je slednja operacija bolj priročna. Posebna metoda optične mikroskopije lahko izsesa polovico dehidracijskega sredstva v posodi vsake 3 minute in nato doda enako količino dehidracijskega sredstva s koncentracijo 100 odstotkov. Po 5-6 operacijah koncentracija dehidracijskega sredstva v mikroskopski posodi doseže nad 0,5 odstotka in celice so uspešno dehidrirane. Po sušenju kritične točke se predmetno stekelce ali plastična plošča prilepi na steber vzorca s prevodnim lepilom za kovinsko prevleko. Obstajajo tudi ugodnosti za pritrditev celic na membrane, ki jih določa tretja metoda. Optični mikroskop lahko obesi celice, fiksirane z nizko koncentracijo glutaraldehida na "aktiviran" proteinski film. Optični mikroskop zahteva, da se debelina stekelca postavi za 10 minut, stekelca ali plastična plošča pa se namoči v 2-odstotni glutaraldehid. Po 30 minutah sperite s filtrirano dvojno destilirano vodo in nato dehidrirajte, posušite in kovinsko prevlečite po zgornji metodi.
