Tehnologija slikanja z večfotonsko mikroskopijo: polarizacijsko-ločljiva druga-harmonična mikroskopija in njena obdelava slike
V nelinearnih optičnih mikroskopih se slikanje generacije druge harmonike (SHG) običajno uporablja za opazovanje endogenih vlaknastih struktur, intenzivnost SHG pa je v veliki meri odvisna od relativnega kota med smerjo polarizacije vpadnega žarka in orientacijsko osjo ciljne molekule. Zato lahko polarizacijsko slikanje SHG (P-SHG) pridobi strukturne informacije o ciljnih molekulah z analizo funkcionalnega razmerja med intenzivnostjo signala SHG in stanjem polarizacije vpadnega žarka. Zdaj se uporablja kot pomembno orodje za medicinsko in biološko analizo.
Enostavne slike SHG je mogoče pridobiti s tradicionalno fluorescenčno mikroskopijo z dvo-fotonskim vzbujanjem (TPM). Večina sistemov TPM še vedno uporablja metodo skeniranja z enim žarkom, ki temelji na premikajočem se zrcalu, katerega časovna ločljivost je odvisna od fizične hitrosti gibanja zrcala. Da bi dosegli hitrejše slikanje, lahko sistem TPM sprejme tudi metodo skeniranja z več žarki (slika 1A), ena od njih je uporaba enote za skeniranje z vrtljivim diskom. Ta enota je sestavljena iz koaksialnega gramofona z mikro lečami in vrtljivega krožnika z luknjicami, pri čemer mikro leče in luknjice na vsakem gramofonu ustrezajo ena-proti-ena.
Ko gre laser skozi vrtljivo ploščo z mikro lečami, valovna fronta pokrije več mikro leč. Različne mikro leče fokusirajo različne dele valovne fronte v različne položaje in prehajajo skozi ustrezne luknje, pri čemer tvorijo več mikro žarkov. Ti mikro žarki, ki zadenejo vzorec, lahko hkrati vzbudijo več signalov. Ti signali se vrnejo vzdolž mikroskopskega sistema in ponovno preidejo skozi luknjico ter se končno odbijejo v dihroičnem zrcalu med obema gramofonoma v detekcijsko napravo. Vendar pa ima pogosto uporabljen način-zaklenjen titanov safirni laser kot svetlobni vir nezadostno energijo, kar omejuje število vzbujevalnih žarkov in ima za posledico majhno efektivno vidno polje (FOV) za TPM (TPM-SD) z uporabo rotacijske enote za skeniranje.
Ai Goto idr. namenjen doseganju visoko{1}}hitrostnega slikanja P-SHG z velikim vidnim poljem (FOV) z uporabo sistema TPM-SD. Zato je bil v sistem TPM-SD uveden laserski vir na osnovi Yb z večjo konično močjo.
To je shematski diagram sistema TPM-SD, ki so ga razvili. Svetlobni vir sistema je laser na osnovi Yb, ki generira femtosekundne impulze s srednjo valovno dolžino 1042 nm, povprečno močjo 4 W, širino impulza 300 fs in hitrostjo ponavljanja 10 MHz. Sistem najprej prilagodi moč laserja s polvalovno ploščo in laserskim polarizatorjem Glan, nato pa žarek razširi s pomočjo ekspanderja žarka. Razširjeni žarek se vnese v enoto za skeniranje gramofona in več mikrožarkov, ki prihajajo iz enote za skeniranje, se usmeri na več točk vzorca skozi lečo objektiva, ki potopi v vodo. Da bi prilagodili stanje polarizacije svetlobnega žarka na leči objektiva, sta na optični poti vzbujalnega žarka nameščeni polvalovna plošča in četrtvalovna plošča.
