Slikanje z večfotonsko mikroskopijo: različne tehnike za slikanje nevronov in vivo
V primerjavi s tradicionalnim enofotonskim širokopoljskim fluorescenčnim mikroskopom ima večfotonska mikroskopija (MPM) funkcije optičnega rezanja in globokega slikanja. Leta 2019 so Jerome Lecoq et al. razpravljali o povezani tehnologiji MPM s treh vidikov: slikanje nevronov globoko v možganih, slikanje masivnih nevronov in slikanje nevronov visoke hitrosti.
Da bi povezali aktivnost nevronov s kompleksnim vedenjem, je običajno treba slikati nevrone v globoki skorji, kar zahteva, da ima MPM sposobnost globokega slikanja. Vzbujevalna in emisijska svetloba se močno razprši in absorbira biološko tkivo, kar je glavni dejavnik, ki omejuje globino slikanja MPM. Čeprav je problem sipanja mogoče rešiti s povečanjem intenzivnosti laserja, bo prinesel druge težave, kot so sežiganje vzorca, defokusiranje in fluorescenčno vzbujanje blizu površine. Najboljši način za povečanje globine slikanja MPM je uporaba daljših valovnih dolžin kot vzbujevalne svetlobe.
Poleg tega sta pri dvofotonskem (2P) slikanju dva največja dejavnika, ki omejujeta globino, vzbujanje fluorescence zunaj fokusa in blizu površine, medtem ko sta pri trifotonskem (3P) slikanju ti dve težavi močno zmanjšani, vendar trifotonsko slikanje zaradi fluorescence. Absorpcijski presek skupine je veliko manjši kot pri 2P, zato je za pridobitev fluorescenčnega signala enake intenzitete, kot ga vzbuja 2P, potrebna za red velikosti višja energija impulza. Funkcionalna 3P mikroskopija je zahtevnejša od strukturne 3P mikroskopije, ki zahteva hitrejše skeniranje za pravočasno vzorčenje nevronske aktivnosti; potrebna je večja energija impulza, da se zbere dovolj signalov v času zadrževanja vsake slikovne pike.
Zapleteno vedenje pogosto vključuje velika možganska omrežja z lokalnimi in daljnosežnimi povezavami. Da bi povezali aktivnost nevronov z vedenjem, je potrebno hkrati spremljati aktivnost zelo velikih in široko razporejenih nevronov. Nevronska mreža v možganih obdela vhodne dražljaje v desetinah milisekund. Da bi razumeli to hitro nevronsko mrežo. Za preučevanje dinamike nevronov mora MPM imeti sposobnost hitrega slikanja nevronov. Hitre metode MPM lahko razdelimo na tehnike skeniranja z enim žarkom in tehnike skeniranja z več žarki.
Tehnologija skeniranja z enim žarkom omogoča visoko hitrost prečkanja živčnega tkiva z velikim vidnim poljem (FOV)
Ko uporabljate MPM za slikanje nevronov, lahko skeniranje z naključnim dostopom – to je, da se laserski žarek hitro skenira na kateri koli izbrani točki na celotnem vidnem polju – skenira samo nevrone, ki vas zanimajo, s čimer se ne le izognete skeniranju vseh neoznačenih živčnih vlaken, temveč optimizira tudi čas skeniranja laserskega žarka. Skeniranje z naključnim dostopom (slika 1) je mogoče doseči z akustično-optičnim deflektorjem (AOD), ki deluje tako, da piezoelektrični pretvornik z radiofrekvenčnim signalom poveže z ustreznim kristalom. Nastali akustični valovi inducirajo periodično rešetko lomnega količnika. Do uklona pride, ko gre laserski žarek skozi rešetko. Intenzivnost in frekvenco zvočnega valovanja je mogoče prilagoditi z radiofrekvenčnim električnim signalom, da se spremeni intenzivnost in smer difraktirane svetlobe, tako da je mogoče realizirati enodimenzionalno vodoravno poljubno točkovno skeniranje z uporabo enega AOD in realizirati 3D. z uporabo para AOD-jev v kombinaciji z drugimi tehnologijami aksialnega skeniranja z naključnim dostopom. Vendar je ta tehnika zelo občutljiva na gibanje vzorca in nagnjena k artefaktom gibanja. Trenutno se široko uporablja hitro rastrsko skeniranje, to je progresivno skeniranje v FOV, saj lahko algoritem zlahka reši artefakte gibanja.
Dvofotonsko slikanje neokortikalnih L2/3 nevronov in vivo na osnovi AOD [2]
Obstaja veliko načinov za realizacijo hitrega rastrskega skeniranja, z uporabo vibrirajočega zrcala za hitro 2D skeniranje, kombinacijo vibrirajočega zrcala in nastavljive električne leče za hitro 3D skeniranje, vendar nastavljiva električna leča ne more hitro izostriti v aksialni smeri zaradi omejitve mehansko vztrajnostno preklapljanje, ki vpliva na hitrost slikanja, je zdaj mogoče nadomestiti s prostorskim modulatorjem svetlobe (SLM).
Daljinsko ostrenje je tudi sredstvo za doseganje 3D-slikanja, kot je prikazano na sliki 2. V modulu LSU skenirni galvanometer skenira vodoravno, modul ASU pa vključuje lečo objektiva L1 in zrcalo M, aksialno skeniranje pa se izvede s prilagoditvijo položaj M. Ta tehnika ne more samo popraviti optične aberacije, ki jo povzroči leča glavnega objektiva L2, ampak tudi omogoči hitro aksialno skeniranje. Da bi pridobili več nevronskih slik, je mogoče FOV povečati s prilagoditvijo zasnove leče objektiva mikroskopa, vendar je leča objektiva z velikim NA in velikim FOV običajno težka in se ne more hitro premikati za hitro aksialno skeniranje, zato se veliki sistemi FOV zanašajo na Telefocus , SLM in nastavljive motorizirane leče.
Shematski diagram dvofotonskega slikovnega sistema z daljinskim fokusiranjem [3] Tehnologija skeniranja z več žarki lahko hkrati slika različne položaje nevronskega tkiva
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 mm narazen) mesta za slikanje (sl. 3C, D); za sosednja območja običajno uporablja več žarkov ene leče objektiva za slikanje (sl. 3E, F). Tehnika skeniranja z več žarki mora posebno pozornost nameniti problemu preslušavanja med vzbujevalnimi žarki, ki ga je mogoče rešiti z metodo ločevanja svetlobnega vira ali metodo prostorsko-časovnega multipleksiranja. Post-hoc metoda ločevanja svetlobnih virov se nanaša na uporabo algoritmov za ločevanje žarkov za odpravo preslušavanja; metoda časovno-prostorskega multipleksiranja se nanaša na hkratno uporabo več vzbujevalnih žarkov, impulzi vsakega žarka so časovno zakasnjeni, tako da se posamezni žarki, ki jih vzbujajo različni žarki, lahko začasno ločijo. fluorescentni signal. Več nevronov je mogoče prikazati z uvedbo več žarkov, vendar bo več žarkov povečalo prekrivanje časa upadanja fluorescence, kar omejuje sposobnost razlikovanja virov signala; in multipleksiranje negativno vpliva na hitrost delovanja elektronskih naprav. Visoke zahteve; veliko število žarkov zahteva tudi večjo moč laserja za vzdrževanje približnega razmerja med signalom in šumom posameznega žarka, kar lahko zlahka povzroči poškodbo tkiva.
Tehnologija slikanja velikih površin
V zadnjih letih je razvoj različnih tehnologij MPM razširil obseg našega slikanja živčnega tkiva, kar nam je omogočilo hitrejše slikanje več nevronov globoko v možganih, kar je močno spodbudilo nevroznanstvene raziskave in nam omogočilo jasnejše razumevanje delovanja možganov.
