Razvrstitev mikroskopije in princip delovanja za raziskave celic
Mikroskop je glavno orodje za opazovanje celic. Glede na različne vire svetlobe ga lahko razdelimo v dve kategoriji: optični mikroskopi in elektronski mikroskopi. Prvi kot vir svetlobe uporablja vidno svetlobo (UV mikroskopi ultravijolično svetlobo), drugi pa elektronske žarke.
-,Optični mikroskop
(1) Navaden optični mikroskop
Navadni biološki mikroskopi so sestavljeni iz treh delov, in sicer: ① osvetljevalni sistem, vključno z virom svetlobe in kondenzatorjem; ② optični sistem povečave, sestavljen iz objektiva in okularja, ki je glavno telo mikroskopa. Da bi odpravili sferično in kromatsko aberacijo, okular in objektiv ③Mehanska naprava, ki se uporablja za pritrditev materiala in olajša opazovanje (slika 2-1).
Ali je slika mikroskopa jasna, ni odvisno samo od povečave, ampak je povezano tudi z ločljivostjo mikroskopa. Ločljivost se nanaša na zmožnost mikroskopa (ali človeškega očesa, da je od tarče oddaljeno 25 cm), da razlikuje najmanjšo razdaljo med predmeti. Velikost ločljivosti je določena z valovno dolžino in razmerjem zaslonke svetlobe ter lomnim količnikom medija sta izražena s formulo:
V formuli: n=lomni količnik medija;=kot zaslonke (kot odprtine vzorca glede na zaslonko objektiva), NA=zaslonka objektiva (numerična zaslonka). Kot leče je vedno manjši od 180 stopinj, zato mora biti največja vrednost sina/2 manjša od 1.
Indeks loma stekla, ki se uporablja za izdelavo optične leče, je od 1,65 do 1,78, lomni količnik uporabljenega medija pa je bližje steklu, tem bolje. Za leče suhega objektiva je medij zrak, razmerje zaslonke leče pa je običajno 0.05 do 0,95; za oljne leče se kot medij uporablja cedrovo olje, razmerje zaslonke leče pa je lahko blizu 1,5.
Valovna dolžina navadne svetlobe je {{0}}nm, zato vrednost ločljivosti mikroskopa ne bo manjša od 0.2μm, ločljivost človeškega očesa pa je 0,2 mm, tako da največja povečava splošne zasnove mikroskopa je običajno 1000X.
(2) Fluorescenčna mikroskopija
Nekatere snovi v celicah, kot je klorofil, lahko po obsevanju z ultravijoličnimi žarki fluorescirajo; nekatere snovi same ne morejo fluorescirati, če pa so obarvane s fluorescenčnimi barvili ali fluorescentnimi protitelesi, lahko fluorescirajo tudi ob obsevanju z ultravijoličnimi žarki in fluorescenčni mikroskop (sl. 2-2, 3, 4) je eno od orodij za kvalitativne in kvantitativne raziskave takih snovi.
Fluorescenčni mikroskopi in navadni mikroskopi imajo naslednje razlike:
1. Metoda osvetlitve je običajno epi-osvetlitev, kar pomeni, da se vir svetlobe projicira na vzorec skozi lečo objektiva (slika 2-3);
2. vir svetlobe je ultravijolična svetloba, valovna dolžina je krajša, ločljivost pa višja kot pri navadnih mikroskopih;
3. Obstajata dva posebna filtra, tisti pred virom svetlobe se uporablja za filtriranje vidne svetlobe, tisti med okularjem in lečo objektiva pa se uporablja za filtriranje ultravijolične svetlobe za zaščito oči.
(3) Laserski skenirajoči konfokalni mikroskop
Laserski konfokalni skenirni mikroskop (laserski konfokalni skenirni mikroskop, slika 2-5, 6) uporablja laser kot skenirni svetlobni vir in skenira slike točko za točko, linijo za linijo, površino za površino, skenirni laser in zbirka fluorescence pa si delita objektiva, fokus leče objektiva pa je žariščna točka laserskega skeniranja je tudi predmetna točka trenutnega slikanja. Ker je valovna dolžina laserskega žarka kratka in je žarek zelo tanek, ima konfokalni laserski vrstični mikroskop višjo ločljivost, ki je približno 3-krat večja od navadnega optičnega mikroskopa. Sistem se fokusira enkrat in skeniranje je omejeno na eno ravnino vzorca. Ko je globina ostrenja različna, je mogoče dobiti slike različnih globin vzorca. Te slikovne informacije so shranjene v računalniku. Z računalniško analizo in simulacijo je mogoče prikazati tridimenzionalno strukturo vzorca celice.
Konfokalna laserska vrstična mikroskopija se lahko uporablja ne samo za opazovanje morfologije celic, ampak tudi za kvantitativno analizo znotrajceličnih biokemičnih komponent, statistiko optične gostote in merjenje morfologije celic.
(4) Mikroskop s temnim poljem
Mikroskop s temnim poljem (mikroskop s temnim poljem, slika 2-7) ima svetlobno ploščo v središču kondenzorja, tako da osvetljevalna svetloba ne vstopi neposredno v človeško lečo, temveč le svetloba, ki jo vzorec odbije in ulomi. dovoljen vstop v lečo objektiva, zato je ozadje vidnega polja črno, robovi predmetov so svetli. S tem mikroskopom je mogoče videti delce, majhne kot 4-200nm, ločljivost pa je lahko 50-krat višja kot pri navadnih mikroskopih.
(5) Fazno kontrastni mikroskop
Faznokontrastni mikroskop (faznokontrastni mikroskop, slika 2-8, 9) P. Zernikeja je izumil leta 1932 in zanj leta 1953 prejel Nobelovo nagrado za fiziko. Največja značilnost tega mikroskopa je, da lahko opazuje neobarvane vzorce in žive celice.
Osnovno načelo fazno kontrastne mikroskopije je spremeniti optično razliko poti vidne svetlobe, ki prehaja skozi vzorec, v razliko amplitude, s čimer se izboljša kontrast med različnimi strukturami in naredijo različne strukture jasno vidne. Po prehodu skozi vzorec se svetloba lomi, odkloni od prvotne optične poti in zakasni za 1/4λ (valovna dolžina). Okrepite, povečajte ali zmanjšajte amplitudo, povečajte kontrast. Z vidika zgradbe imajo fazno kontrastni mikroskopi dve posebnosti, ki se razlikujejo od običajnih optičnih mikroskopov:
1. Obročasta diafragma se nahaja med svetlobnim virom in kondenzorjem, njena funkcija pa je, da svetloba, ki prehaja skozi kondenzor, oblikuje votel svetlobni stožec in se osredotoči na vzorec.
2. Fazna plošča (obročasta fazna plošča) doda fazno ploščo, prevlečeno z magnezijevim fluoridom v lečo objektiva, ki lahko zakasni fazo direktne svetlobe ali difraktirane svetlobe za 1/4λ. Obstajata dve vrsti:
①A plus fazna plošča: Neposredna svetloba je zakasnjena za 1/4λ. Ko se obe skupini svetlobnih valov združita, se svetlobni valovi seštejejo in amplituda se poveča. Struktura vzorca je svetlejša od okoliškega medija in tvori svetel kontrast (ali negativni kontrast).
② B plus fazna plošča: Uklonjena svetloba zakasni za 1/4λ. Ko se oba niza žarkov združita, se svetlobni valovi odštejejo in amplituda postane manjša, tvori temen kontrast (ali pozitivni kontrast), struktura pa je temnejša od okoliškega medija.
(6) Polarizacijski mikroskop
Polarizacijski mikroskop se uporablja za odkrivanje snovi z dvolomnostjo, kot so filamenti, vretena, kolagen, kromosomi itd. Razlika od navadnih mikroskopov je v tem, da je pred virom svetlobe polarizator (polarizator), tako da je svetloba, ki vstopa v mikroskop, polarizirana svetloba, v njem pa je analizator (polarizator, katerega smer polarizacije je pravokotna na polarizator). tulec objektiva. Mizico tega mikroskopa je mogoče vrteti. Ko je na mizico postavljena snov z enim lomom, ne glede na to, kako je mizica obrnjena, ker sta oba polarizatorja navpična, v mikroskopu ni mogoče videti svetlobe in svetloba v mikroskopu ni vidna. Pri vstopu v dvolomne materiale lahko vrtljiva stopnica zazna takšne predmete, ker se svetloba pri prehodu skozi take materiale odkloni.
