Učilnica za mikroskopsko slikanje丨Uporaba fluorescenčne mikroskopije
Fluorescenčna mikroskopija s popolnim notranjim odbojem (TIRFM) je tehnika, ki uporablja evanescentno valovanje, ki ga ustvari svetlobni žarek, ki se širi med dvema medijema z različnim lomnim indeksom, za sondiranje površine fluorescentno označenih živih celic. V praksi, ko vpadni laserski žarek naleti na vmesnik med pokrovnim stekelcem in vodnim medijem, ki vsebuje celice, se odbije pod kritičnim kotom (popolni notranji odboj). Ker energija evanescentnega vala eksponentno upada z razdaljo od pokrovnega stekelca, so fluoroforji znotraj 10 nanometrov od površine (med 10 in 200 nanometrov) vzbujeni z evanescent valom, medtem ko so fluoroforji dlje oddaljeni večinoma nevzbujeni. Prizadeti. Tako TIRFM povzroči visoke ravni signala iz fluoroforjev, ki se nahajajo v bližini pokrovnega stekelca, nanesenih na zelo temno ozadje, kar zagotavlja odlično razmerje med signalom in šumom. Ekstremna omejitev globine vzbujanja je idealna za preučevanje posameznih molekul ali sestave membran in organelov v adherentnih celicah blizu površine pokrovnega stekeca (glej sliko 8(e)). Ker je vzbujanje omejeno na tanke regije v bližini pokrovnega stekelca, sta fotobeljenje in fototoksičnost omejeni tudi na te regije, zaradi česar je TIRFM ena najbolj uporabnih metod za dolgoročno opazovanje. Tehnika je postala temeljno orodje za proučevanje širokega nabora pojavov v celični in molekularni biologiji.
Dekonvolucija je algoritem, ki se uporablja za niz slik z vsemi žarišči, pridobljenih vzdolž optične (Z) osi za izboljšanje fotonskega signala v nizu slik za dano ravnino slike ali več goriščnih ravnin. Mikroskopi morajo biti opremljeni z visoko natančnimi motoriziranimi pogoni za ostrenje, da se zagotovi zajem slike v natančno določenih intervalih med goriščnimi ravninami vzorca. V tipični aplikaciji (glej sliko 8(f)) se postopek dekonvolucije uporablja za zameglitev in odstranitev neizostrene svetlobe iz dane goriščne ravnine z uporabo vzbujanja in emisije širokopoljske fluorescence. Najbolj zapletena aplikacija je uporaba postopka dekonvolucije za celoten sklad slik za ustvarjanje projiciranih pogledov ali 3D modelov. Niz slik širokega polja, uporabljenih za dekonvolucijo, zajame teoretično največje število fotonov, ki jih odda vzorec. Postopek dekonvolucije prerazporedi "zamegljene" intenzitete fotonov, oddanih nad in pod goriščno ravnino, nazaj na prvotno ravnino. Tako dekonvolucija uporablja skoraj vse razpoložljive intenzivnosti emisij in zagotavlja optimalen svetlobni proračun, zaradi česar je ta tehnika izbrana metoda za vzorce, ki so zelo občutljivi na svetlobo.
Različica pojava resonančnega prenosa energije pri fluorescenčni mikroskopiji, fluorescenčni ali Försterjev resonančni prenos energije (FRET) se uporablja za pridobivanje kvantitativnih časovnih in prostorskih informacij o vezavi in interakciji proteinov, lipidov, encimov in nukleinskih kislin v živih celicah. FRET lahko uporablja bodisi tehnike konstantnega stanja bodisi tehnike časovne ločljivosti, vendar ima slikanje FRET s časovno ločljivostjo to prednost, da natančneje preslika razdalje donorjev in sprejemnikov. Za slikanje FRET je mogoče uporabiti standardni fluorescenčni mikroskop s širokim poljem, opremljen z ustreznimi vzbujevalnimi in emisijskimi filtri ter občutljivo kamero. Biosenzorji, ki vstavijo okolju občutljiv protein ali peptid med dva fluorescenčna proteina, ki se uporabljata za FRET, se trenutno pogosto uporabljajo v celični biologiji. Te sonde je mogoče enostavno slikati pod fluorescenčno mikroskopijo s širokim poljem z uporabo senzibiliziranih emisijskih tehnik FRET v kombinaciji z raciometrično analizo. Poleg tega lahko spektralno slikanje in linearno nemešanje z uporabo konfokalne mikroskopije z laserskim skeniranjem pomagata pri spremljanju pojavov FRET v biosenzorjih in drugih aplikacijah fluorescentnih beljakovin.
Fluorescenčna življenjska doba slikovne mikroskopije (FLIM) je sofisticirana tehnika, ki lahko hkrati beleži življenjsko dobo fluorescence in prostorsko lokacijo fluoroforja na vsaki lokaciji na sliki. Ta metoda zagotavlja mehanizem za preučevanje okoljskih parametrov, kot so pH, ionska koncentracija, polarnost topila, nekovalentne interakcije, viskoznost in napetost kisika v posameznih živih celicah, ter predstavi podatke v prostorskih in časovnih nizih. Meritve FLIM življenjskih dob vzbujenega stanja na nanosekundni lestvici so neodvisne od lokalnih koncentracij fluoroforjev, učinkov fotobeljenja in dolžine poti (debeline vzorca), vendar so občutljive na reakcije vzbujenega stanja, kot je resonančni prenos energije. Pravzaprav se združevanje FLIM s FRET s spremljanjem življenjskih sprememb fluorescenčnih donorjev pred in po resonančnem prenosu energije šteje za enega najboljših načinov za preučevanje tega pojava.
Mobilnost (prečni difuzijski koeficient) fluorescentno označenih makromolekul in majhnih fluoroforjev je mogoče določiti s tehniko obnovitve fluorescence po fotobeljenju (FRAP). Pri FRAP je zelo majhno izbrano območje (premera nekaj mikrometrov) intenzivno osvetljeno, običajno z laserjem, da se povzroči popolno fotobeljenje fluoroforja na tem območju. Rezultat je dramatično zmanjšanje ali izničenje fluorescence. Po impulzu fotobeljenja sta bila hitrost in obseg okrevanja intenzivnosti fluorescence v beljenih območjih spremljana kot funkcija časa pri nizkih intenzivnostih vzbujanja, da bi pridobili informacije o kinetiki repopulacije in okrevanja fluoroforja (slika 9). FRAP se običajno izvaja z uporabo EGFP ali drugih fluorescenčnih proteinov. Sorodne tehnike fotoaktivacije temeljijo na posebnih sintetičnih fluoroforjih v kletkah ali podobno funkcionalnih fluorescenčnih proteinih, ki jih je mogoče aktivirati s kratkimi impulzi UV ali vijolične barve. Fotoaktivacija in FRAP se lahko uporabljata kot dopolnilni tehniki za določanje parametrov mobilnosti.
V tehniki, povezani s FRAP, imenovani izguba fluorescence po fotobeljenju (FLIP), je določena fluorescentna regija znotraj žive celice podvržena ponavljajočemu fotobeljenju z intenzivnim obsevanjem. Če bi lahko vsi fluoroforji difundirali v območje, ki je bilo fotobeljeno v izmerjenem časovnem obdobju, bi to povzročilo popolno izgubo fluorescentnega signala v celici. Z izračunom hitrosti, s katero fluorescenca izgine iz celotne celice, je mogoče določiti difuzijsko mobilnost ciljnega fluoroforja. Poleg tega lahko FLIP zlahka prepozna lokacijo in naravo kakršnih koli difuzijskih ovir med posameznimi deli celic, kot je pregrada med somo in aksonom nevrona.
Fluorescenčna korelacijska spektroskopija (FCS), ki se večinoma uporablja v laserski skenirni konfokalni mikroskopiji ali večfotonski mikroskopiji, je metoda, zasnovana za določanje kinetičnih informacij, kot so hitrosti kemijske reakcije, difuzijski koeficienti, tehnike za molekulsko maso, pretok in agregacijo. Pri FCS je majhna prostornina (približno en femtometer; z difrakcijo omejeno žarišče laserja) osvetljena z fokusiranim laserskim žarkom, da se zabeležijo nihanja intenzivnosti avtofluorescence, ki jih povzroči dinamika fluorescenčnih molekul kot funkcija časa v prostornini, ki jo zasedajo fluorescence. molekule (slika 10). Relativno majhni fluoroforji hitro difundirajo v osvetljenem volumnu in proizvajajo kratke izbruhe naključne intenzivnosti. Nasprotno pa se večji kompleksi (fluoroforji, vezani na makromolekule) premikajo počasneje in proizvajajo daljše, obstojnejše vzorce intenzitete fluorescence, odvisne od časa.
Ko so fluorescentno označene strukture gosto zapakirane in se prekrivajo v določenih regijah živih celic, je njihovo dinamiko in prostorsko porazdelitev težko analizirati. Fluorescenčna točkovna mikroskopija (FSM) je tehnika, združljiva s skoraj vsemi načini slikanja, ki izkorišča zelo nizke koncentracije fluorescentno označenih podenot, zmanjša fluorescenco zunaj žarišča in izboljša vidnost označenih struktur in njihovo dinamiko v debelih regijah. FSM se izvajajo z označevanjem le delčka celotne interesne strukture. V tem smislu je FSM podoben izvajanju FCS po celotnem vidnem polju, čeprav daje večji poudarek prostorskim vzorcem namesto kvantitativni časovni analizi. Fluorescentna točkovna mikroskopija je še posebej uporabna pri določanju mobilnosti in agregacije citoskeletnih elementov, kot so aktin in mikrotubuli v hiperaktivnih celicah.
Stimulirana emisijska osiromašena mikroskopija (STED) je nastajajoča tehnika visoke ločljivosti s prostorsko ločljivostjo, ki daleč presega uklonsko mejo, z uporabo obročasto osiromašene svetlobe, ki obdaja manjši snop vzbujalne svetlobe, da dobi pod-50 nm na osi resolucija. Tehnika temelji na vzbujanju fluoroforjev s sinhroniziranimi laserskimi impulzi in prostorsko usklajenimi krožnimi impulzi STED, ki osiromašijo oddano svetlobo in zavirajo fluorescenco vzbujenih molekul okoli žarišča laserskega skeniranja. Fluorescenca, ustvarjena na obrobju pege, je potlačena, ne pa tudi v središču pege, s čimer se znatno zmanjša velikost fluorescentne pege in ustrezno znatno poveča ločljivost. STED se je izkazal za uporabno orodje za odkrivanje živih celic z visoko ločljivostjo. Druge nastajajoče tehnike super ločljivosti, kot sta fotoaktivirana lokalizacijska mikroskopija (PALM) in mikroskopija s strukturirano svetlobo (SIM), bodo v bližnji prihodnosti prav tako postala temeljna orodja za slikanje živih celic.
Vse večja uporaba gensko kodiranih fluorescenčnih proteinov in naprednih sintetičnih fluoroforjev za slikanje živih celic odpira vrata novim optičnim modalitetam za spremljanje časovne dinamike in prostorskih odnosov. Mikroskopisti imajo zdaj popoln nabor orodij za opazovanje in snemanje slikovnih podatkov o celičnih procesih, ki potekajo v širokem razponu časovnih okvirov in pri več ločljivostih. Počasnejše dogodke je mogoče zlahka opazovati in zabeležiti z lasersko skenirajočo konfokalno mikroskopijo, medtem ko je mogoče hitrejše kinetične dogodke doseči s tehnologijo vrtečega se diska. Poleg tega večfotonska mikroskopija omogoča globoko slikanje v debelih tkivih, tehnike popolnega notranjega odboja pa omogočajo sondiranje membranskih površin s konfokalno natančnostjo. Napredne fluorescenčne metode, kot so FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM in STED, se lahko uporabljajo za spremljanje interakcij protein-protein pri ločljivostih, ki so pogosto boljše od tistih, ki jih dovoljuje uklonska meja. Z napredkom v tehnologiji fluoroforja, mikroskopa in detektorja bo "pod mikroskop" postavljen širši svet.
