Razlika med običajnim mikroskopom in fluorescenčnim mikroskopom
Fluorescenčni mikroskopi uporabljajo ultravijolično svetlobo kot vir svetlobe za obsevanje predmeta, ki ga pregledamo, tako da predmet oddaja svetlobo, nato pa predmet opazujemo pod mikroskopom. Uporablja se predvsem za imunofluorescenčne celice. V glavnem je sestavljen iz vira svetlobe, sistema filtrirnih plošč in optičnega sistema za opazovanje fluorescenčne slike vzorca skozi povečavo okularja in leče objektiva. Oglejmo si razliko med tem fluorescenčnim mikroskopom in navadnim optičnim mikroskopom.
1. Glede na metode osvetlitve
Metoda osvetlitve fluorescenčnega mikroskopa je na splošno episkopska, kar pomeni, da se vir svetlobe projicira na preskusni vzorec skozi lečo objektiva.
2. V smislu ločljivosti
Fluorescenčni mikroskopi kot vir svetlobe uporabljajo ultravijolično svetlobo. Valovna dolžina je razmeroma kratka, vendar je ločljivost višja kot pri običajnih optičnih mikroskopih.
3. Razlika v filtru
Fluorescenčni mikroskop uporablja dva posebna filtra, ki se uporabljata pred svetlobnim virom za filtriranje vidne svetlobe in med lečo objektiva in okularjem za filtriranje ultravijolične svetlobe, ki lahko zaščiti človeške oči.
Fluorescenčni mikroskop je tudi neke vrste optični mikroskop, predvsem zato, ker je valovna dolžina, ki jo vzbuja fluorescenčni mikroskop, kratka, kar vodi do razlike v strukturi in uporabi med fluorescenčnim mikroskopom in navadnim mikroskopom. Večina fluorescenčnih mikroskopov ima dobro funkcijo zajemanja šibke svetlobe, zato je pri izjemno šibki fluorescenci tudi njihova sposobnost slikanja dobra. Skupaj z nenehnim izboljševanjem fluorescenčnih mikroskopov v zadnjih letih se je močno zmanjšal tudi hrup. Zato se uporablja vedno več fluorescenčnih mikroskopov.
Poznavanje dvofotonske fluorescenčne mikroskopije
Osnovno načelo dvofotonskega vzbujanja je: v primeru visoke gostote fotonov lahko fluorescentne molekule absorbirajo dva fotona z dolgo valovno dolžino hkrati in oddajajo foton s krajšo valovno dolžino po kratkem obdobju tako imenovane življenjske dobe v vzbujenem stanju. . ; učinek je enak, kot če bi uporabili foton, katerega valovna dolžina je polovica dolge valovne dolžine, da vzbudimo fluorescentno molekulo. Dvofotonsko vzbujanje zahteva visoko gostoto fotonov. Da ne bi poškodovali celic, dvofotonska mikroskopija uporablja visokoenergijske impulzne laserje z zaklenjenim načinom. Laser, ki ga oddaja ta laser, ima visoko temensko energijo in nizko povprečno energijo, njegova impulzna širina je le 100 femtosekund, njegova frekvenca pa lahko doseže 80 do 100 megahercev. Pri uporabi leče objektiva z visoko numerično odprtino za fokusiranje fotonov impulznega laserja je gostota fotonov v gorišču leče objektiva največja, dvofotonsko vzbujanje pa se pojavi samo v gorišču leče objektiva, tako da dvofotonski mikroskop ne potrebuje konfokalne luknjice, kar izboljša učinkovitost zaznavanja fluorescence.
Pri splošnih pojavih fluorescence lahko zaradi nizke gostote fotonov vzbujalne svetlobe fluorescenčna molekula absorbira le en foton hkrati in nato odda fluorescenčni foton skozi sevalni prehod, ki je enofotonska fluorescenca. Pri procesu vzbujanja fluorescence z uporabo laserja kot vira svetlobe lahko pride do dvofotonske ali celo večfotonske fluorescence. V tem času je intenzivnost uporabljenega vzbujalnega svetlobnega vira visoka, gostota fotonov pa ustreza zahtevam fluorescenčnih molekul, ki absorbirajo dva fotona hkrati. V procesu uporabe splošnega laserja kot vzbujalnega vira svetlobe gostota fotonov še vedno ni dovolj, da bi povzročil pojav dvofotonske absorpcije. Običajno se uporablja femtosekundni impulzni laser, njegova trenutna moč pa lahko doseže megavatov. Zato je valovna dolžina dvofotonske fluorescence krajša od valovne dolžine vzbujalne svetlobe, kar je enakovredno učinku, ki ga povzroči vzbujanje pri polovici vzbujalne valovne dolžine.
Dvofotonska fluorescenčna mikroskopija ima številne prednosti:
1) Na dolgovalovno svetlobo manj vpliva sipanje kot na kratkovalovno svetlobo in zlahka prodre skozi vzorec;
2) Fluorescentne molekule zunaj goriščne ravnine niso vzbujene, tako da lahko več vzbujevalne svetlobe doseže goriščno ravnino, tako da lahko vzbujevalna svetloba prodre v globlje vzorce;
3) Dolgovalovna bližnja infrardeča svetloba je manj strupena za celice kot kratkovalovna svetloba;
4) Pri uporabi dvofotonskega mikroskopa za opazovanje vzorcev pride do fotobeljenja in fototoksičnosti samo v goriščni ravnini. Zato je dvofotonska mikroskopija primernejša od enofotonske mikroskopije za opazovanje debelih vzorcev, za opazovanje živih celic ali za poskuse točkovnega fotobeljenja.
Poznavanje konfokalne fluorescenčne mikroskopije
Osnovno načelo konfokalne fluorescenčne mikroskopije: za obsevanje vzorca se uporablja točkovni vir svetlobe, na goriščni ravnini pa se oblikuje dobro definirana majhna svetlobna točka. sestavljen iz razdelilnikov. Razdelilnik žarka pošlje fluorescenco neposredno v detektor. Pred virom svetlobe in detektorjem je luknjica, imenovana luknjica za osvetljevanje in luknjica za zaznavanje. Geometrijska velikost obeh je enaka, približno 100-200nm; glede na svetlobno točko na goriščni ravnini sta konjugirani, kar pomeni, da svetlobna točka prehaja skozi niz leč in se na koncu lahko istočasno izostri na luknjico za osvetlitev in luknjo za zaznavanje. Na ta način se lahko svetloba iz goriščne ravnine konvergira znotraj obsega zaznavne luknje, medtem ko je razpršena svetloba nad ali pod goriščno ravnino blokirana zunaj zaznavne luknje in je ni mogoče prikazati. Laser skenira vzorec točko za točko, fotopomnoževalna cev pa po zaznavi luknjice pridobi tudi konfokalno sliko ustrezne svetlobne točke točko za točko, ki se pretvori v digitalni signal in prenese v računalnik ter na koncu združi v jasno sliko. konfokalna slika celotne goriščne ravnine na zaslonu.
Vsaka slika goriščne ravnine je pravzaprav optični prerez vzorca. Ta optični prerez ima vedno določeno debelino, znano tudi kot optični tanki prerez. Ker je jakost svetlobe v gorišču veliko večja od intenzivnosti v negoriščni točki in je svetloba negoriščne ravnine filtrirana z luknjico, je globinska ostrina konfokalnega sistema približno enaka nič, skeniranje vzdolž Z -os lahko realizira optično tomografijo, ki tvori Opazujte dvodimenzionalni optični odsek na fokusirani točki vzorca. S kombiniranjem skeniranja ravnine XY (goriščne ravnine) s skeniranjem osi Z (optične osi) je mogoče dobiti tridimenzionalno sliko vzorca s kopičenjem dvodimenzionalnih slik neprekinjenih plasti in obdelavo s posebno računalniško programsko opremo.
To pomeni, da sta zaznavna luknjica in luknjica svetlobnega vira vedno osredotočena na isto točko, tako da fluorescenca, vzbujena zunaj goriščne ravnine, ne more vstopiti v zaznavno luknjico.
Preprost izraz principa delovanja laserskega konfokalnega laserja je, da uporablja laser kot svetlobni vir in na podlagi tradicionalnega slikanja s fluorescenčnim mikroskopom dodaja lasersko skeniranje in konjugirano fokusiralno napravo ter je sistem za pridobivanje digitalne slike in obdelava z računalniškim nadzorom.
