Razlika med fluorescenčnim mikroskopom in navadnim mikroskopom
Nedavno sem poskušal narediti nekaj zamrznjenih kosov miši. Nato bom s fluorescenčnim mikroskopom videl, ali je virus, ki sem ga vbrizgal, v možganskem predelu, ki ga želim. Na kratko se je treba naučiti nekaj osnovnih principov fluorescenčne mikroskopije, ki jih bom delil tukaj.
Fluorescenčni mikroskopi uporabljajo ultravijolično svetlobo kot vir svetlobe za osvetlitev pregledanega predmeta, zaradi česar predmet oddaja svetlobo in nato opazuje predmet pod mikroskopom. Uporablja se predvsem za imunofluorescenčne celice. V glavnem je sestavljen iz vira svetlobe, sistema filtrirnih plošč in optičnega sistema. Fluorescentno sliko vzorca opazujemo s povečavo okularja in objektiva. Oglejmo si razliko med fluorescenčnim mikroskopom in navadnim optičnim mikroskopom.
1. Poglejte način osvetlitve
Metoda osvetlitve fluorescenčnega mikroskopa je na splošno epi-osvetlitev, kar pomeni, da je vir svetlobe postavljen na preskusni vzorec skozi lečo objektiva.
2. Poglejte ločljivost
Fluorescenčni mikroskopi kot vir svetlobe uporabljajo ultravijolično svetlobo, ki ima krajšo valovno dolžino, a višjo ločljivost kot običajni optični mikroskopi.
3. Razlike v filtrih
Fluorescenčni mikroskopi uporabljajo dva posebna filtra, enega pred svetlobnim virom za filtriranje vidne svetlobe, drugega pa med lečo objektiva in okularjem za filtriranje ultravijoličnih žarkov, ki lahko zaščitijo človeške oči.
Fluorescenčni mikroskop je tudi vrsta optičnega mikroskopa. Glavni razlog je, da je valovna dolžina, ki jo vzbuja fluorescenčni mikroskop, kratka, kar vodi do razlike v strukturi in uporabi med fluorescenčnim mikroskopom in običajnim mikroskopom. Večina fluorescenčnih mikroskopov ima dobro funkcijo zajemanja šibke svetlobe. , zato je njegova sposobnost slikanja dobra tudi pri izjemno šibki fluorescenci. Skupaj z nenehnim izboljševanjem fluorescenčnih mikroskopov v zadnjih letih se je močno zmanjšal tudi hrup. Zato se uporablja vedno več fluorescenčnih mikroskopov.
Poznavanje dvofotonske fluorescenčne mikroskopije
Osnovno načelo dvofotonskega vzbujanja je: pod pogojem visoke gostote fotonov lahko fluorescentne molekule absorbirajo dva fotona z dolgimi valovnimi dolžinami hkrati in po kratkem tako imenovanem času vzbujenega stanja oddajo foton s krajšo valovno dolžino. . ;Učinek je enak, kot če bi uporabili foton z valovno dolžino, ki je polovica dolge valovne dolžine, za vzbujanje fluorescenčnih molekul. Dvofotonsko vzbujanje zahteva visoko gostoto fotonov. Da ne bi poškodovali celic, dvofotonski mikroskopi uporabljajo visokoenergijske impulzne laserje z zaklenjenim načinom. Ta laser oddaja lasersko svetlobo z visoko konično energijo in nizko povprečno energijo, s širino impulza le 100 femtosekund in frekvenco od 80 do 100 MHz. Pri uporabi leče objektiva z visoko numerično zaslonko za ostrenje fotonov impulznega laserja je gostota fotonov v gorišču leče objektiva največja. Dvofotonsko vzbujanje se pojavi le v žarišču leče objektiva, zato dvofotonski mikroskop ne potrebuje konfokalne luknjice, kar izboljša učinkovitost zaznavanja fluorescence.
V splošnem pojavu fluorescence lahko zaradi nizke gostote fotonov vzbujalne svetlobe fluorescentna molekula absorbira le en foton hkrati in nato odda en fluorescenčni foton skozi sevalni prehod. To je enofotonska fluorescenca. Pri procesu vzbujanja fluorescence z uporabo laserja kot vira svetlobe lahko pride do pojava dvofotonske ali celo večfotonske fluorescence. V tem primeru je intenzivnost uporabljenega vzbujalnega svetlobnega vira visoka, gostota fotonov pa izpolnjuje zahtevo, da fluorescentne molekule absorbirajo dva fotona hkrati. V procesu uporabe običajnih laserjev kot vzbujevalnih svetlobnih virov gostota fotonov še vedno ni dovolj za ustvarjanje dvofotonske absorpcije. Običajno se uporabljajo femtosekundni impulzni laserji, katerih trenutna moč lahko doseže raven megavatov. Zato je valovna dolžina dvofotonske fluorescence krajša od valovne dolžine vzbujalne svetlobe, kar je enakovredno učinku, ki ga povzroči vzbujanje valovne dolžine s polovično vzbujanjem.
