Trend razvoja konfokalne mikroskopije
Da bi dosegli boljše rezultate opazovanja na tehnični ravni, se konfokalna mikroskopija osredotoča na izboljšanje tehnične ravni z vidika izboljšanja ločljivosti, zmanjšanja fototoksičnosti, povečanja hitrosti skeniranja, opazovanja debelih vzorcev in opazovanja in vivo. Trenutno je Z učinkovito. Tisto, kar promovira tehnologijo Zda za konfokalno mikroskopijo, je mikroskopija z ultra visoko ločljivostjo, ki prebije optično mejo in omogoča raziskovalcem pridobitev finejših celičnih struktur, kar vodi k globljemu razumevanju življenjskih aktivnosti raziskovalcev. Naslednji raziskovalni fokus tehnologije konfokalne mikroskopije bi se moral osredotočiti na naslednje točke:
1. Večja hitrost skeniranja
Trenutno je hitrost konfokalnega skeniranja omejena z mehansko strukturo opreme za skeniranje, ločljivost pa je mogoče žrtvovati samo zato, da bi dosegli večjo hitrost skeniranja. Številni biološki procesi so tako hitri, da jih ni mogoče zaznati.
2. Popolnejša tehnologija ultra visoke ločljivosti
Trenutno tehnologije ultra visoke ločljivosti vključujejo STORM, PALM, STED in SSIM z ločljivostmi od 20 do 200 nm, vendar ima vsaka tehnologija določene napake, kot so obdelava vzorcev, smer osi Z, fototoksičnost itd. ni skoraj popolna in pogosto je težko doseči mejno ločljivost pri dejanskem opazovanju.
3. Močnejša združljivost
Tehnologija konfokalne mikroskopije vključuje različne metode vzbujanja, kot je zgoraj omenjeno večfotonsko in svetlobno opazovanje, in koherentno anti-Stokesovo ramansko sipanje lahko teoretično deli nabor laserskih sistemov. Mikroskopijo visoke ločljivosti je mogoče združiti s tehnologijo belega laserja. Vendar pa je zaradi težav s patenti različnih podjetij še vedno prostor za izboljšave v smislu popolnosti in združljivosti, trenutna oprema pa ne more v celoti izkoristiti tehničnih prednosti aplikacije.
Načela konfokalne mikroskopije
Konfokalni mikroskop je sestavljen iz štirih delov: mikroskopskega optičnega sistema, laserskega vira svetlobe, skenerja ter sistema za zaznavanje in obdelavo. Kot vir svetlobe uporablja laser z dobro koherenco. Sprejema princip konjugiranega fokusiranja in napravo na podlagi tradicionalnega optičnega mikroskopa ter uporablja računalniški niz opazovanja, analize in izhodnega sistema za obdelavo slik.
Laserski skenirni žarek prehaja skozi luknjico rešetke in tvori točkovni svetlobni vir, ki se skozi razdelilnik žarka odbije na lečo objektiva, usmeri na vzorec in skenira. Ko je vzorec vzburjen, se oddana fluorescenca vrne v spektroskop in jo zbere v luknjo za zaznavanje, nato pa jo fotopomnoževalna cev pretvori v električni signal in prenese v računalnik za prikaz jasne slike v goriščni ravnini. Vzbujevalna svetloba je usmerjena na vzorec skozi luknjo na mrežici, fluorescenca pa je usmerjena na luknjico skozi lečo objektiva. Ta proces tvori dve fokusi, zato se imenuje konfokalni mikroskop.
Navadni biološki vzorci imajo kompleksno strukturo in določeno debelino. Pri opazovanju z navadnim fluorescenčnim mikroskopom se fluorescenca, ki jo oddaja vzorec, med seboj prekriva, ločljivost slike pa se močno zmanjša.
Konfokalno slikanje konfokalnega mikroskopa lahko učinkovito prepreči vstop razpršene svetlobe in nemerilne svetlobe zunaj goriščne ravnine v detektor, realizira slikanje ene žariščne ravnine in močno izboljša ločljivost. Ko se stopnica enakomerno premika v vodoravni smeri, lahko tvori jasno enoslojno sliko, v navpični smeri pa lahko realizira poplastno skeniranje vzorca na različnih globinah in pridobi tridimenzionalno strukturo vzorca po tridimenzionalni rekonstrukciji, ki je tako imenovani »optični CT«. Vzorec se označi s fluorescentno sondo in nato opazuje s konfokalnim mikroskopom. Ne samo, da je mogoče opazovati različne fiksne celice in tkivne strukture, temveč je mogoče kvalitativno in kvantitativno opazovati in redno meriti tudi morfologijo, strukturo in ione živih celic.
