Primerjava med konfokalnim mikroskopom in navadnim optičnim mikroskopom
Splošni optični mikroskop
Splošni biološki mikroskop je sestavljen iz treh delov, in sicer: ① sistem osvetlitve, vključno z virom svetlobe in kondenzatorjem; ② Optični ojačitveni sistem, ki je sestavljen iz objektiva in okularja, je glavno telo mikroskopa. Da bi odpravili sferično in kromatsko aberacijo, sta okular in leča objektiva sestavljena iz kompleksnih skupin leč; (3) mehanska naprava, ki se uporablja za pritrjevanje materialov in priročno opazovanje.
Ali je mikroskopska slika jasna ali ne, ni odvisno samo od povečave, ampak tudi od ločljivosti mikroskopa. Ločljivost se nanaša na zmožnost mikroskopa (ali mesta, kjer so človeške oči 25 cm oddaljene od tarče), da razlikuje majhen interval predmeta zui. Ločljivost je odvisna od valovne dolžine svetlobe, razmerja zaslonke in lomnega količnika medija, ki ga izrazimo s formulo:
R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsin /2
Kje je: n= lomni količnik medija;=zrcalni kot (kot odprtine vzorca glede na odprtino leče) in NA= numerična odprtina. Zrcalni kot je vedno manjši od 180? Zato mora biti vrednost zui sina/2 manjša od 1.
Indeks loma stekla, ki se uporablja za izdelavo optičnih leč, je 1,65 ~ 1,78, lomni količnik uporabljenega medija pa je bližje količniku stekla, tem bolje. Za lečo suhega objektiva je medij zrak, razmerje zaslonke pa je običajno 0.05 ~ 0,95; Oljna leča kot medij uporablja dišeči asfalt, stopnja odpiranja leče pa je lahko blizu 1,5.
Valovna dolžina navadne svetlobe je 400~700 nm, zato ločljivost mikroskopa ni manjša od 0,2 μm, ločljivost človeškega očesa pa je 0,2 mm, zato je veliko povečavo zuija zasnoval splošni mikroskop je običajno 1000X x.
Zakaj potrebujete konfokalni mikroskop?
1. Optični mikroskop je bil izpopolnjen s prizadevanji in izboljšavami naših velikih predhodnikov. Pravzaprav nam lahko običajni mikroskopi preprosto in hitro zagotovijo čudovite mikroskopske slike. Zgodil pa se je dogodek, ki je v ta skoraj popoln svet mikroskopov prinesel revolucionarno inovacijo, to je izum "laserskega skenirajočega konfokalnega mikroskopa". Za ta novi mikroskop je značilno sprejetje optičnega sistema, ki samo ekstrahira informacije o sliki na ravnini, kjer je koncentriran fokus, in obnovi pridobljene informacije v pomnilniku slike med spreminjanjem fokusa, tako da je živa slika s popolnimi tridimenzionalnimi informacijami mogoče dobiti. S to metodo lahko preprosto pridobimo podatke o obliki površine, ki jih z običajnimi mikroskopi ne moremo potrditi. Poleg tega sta za običajne optične mikroskope "izboljšanje ločljivosti" in "poglabljanje globine fokusa" nasprotujoča si pogoja, zlasti pri veliki povečavi, toda za konfokalne mikroskope je ta problem rešen.
2. Prednosti konfokalnega optičnega sistema
Konfokalni optični sistem osvetljuje vzorčno točko, odbito svetlobo pa sprejemajo tudi točkovni receptorji. Ko je vzorec postavljen v položaj fokusa, lahko skoraj vsa odbita svetloba doseže fotoreceptor, ko pa vzorec odstopi od fokusa, odbita svetloba ne more doseči fotoreceptorja. To pomeni, da bo v konfokalnem optičnem sistemu izhodna le tista slika, ki sovpada z žariščem, fakula in neuporabna razpršena svetloba pa bosta zaščiteni.
3. Zakaj uporabljati laser?
V konfokalnem optičnem sistemu je vzorec osvetljen, odbito svetlobo pa sprejme tudi točkovni fotoreceptor. Zato je potreben točkovni vir svetlobe. Laser spada med zelo točkovne vire svetlobe. V večini primerov vir svetlobe konfokalnega mikroskopa sprejme laserski vir svetlobe. Poleg tega so lastnosti laserja, kot so monokromatičnost, usmerjenost in odlična oblika žarka, prav tako pomembni razlogi za njegovo široko uporabo.
4. Možno je opazovanje v realnem času, ki temelji na hitrem skeniranju.
Pri laserskem skeniranju se v vodoravni smeri uporablja akustični optični deflektor (AO primarni element), v navpični smeri pa Servo Galvano-zrcalo. Ker v akustični optični odklonski enoti ni dela z mehanskimi vibracijami, lahko skenira pri visoki hitrosti in je mogoče opazovati v realnem času na nadzornem zaslonu. Visoka hitrost te kamere je zelo pomemben projekt, ki neposredno vpliva na hitrost ostrenja in iskanja položaja.
5. Razmerje med položajem fokusa in svetlostjo
V konfokalnem optičnem sistemu, ko je vzorec pravilno postavljen v položaj fokusa, je svetlost velika, pred in za njim pa bo njegova svetlost močno padla (polna črta na sliki 4). Ta občutljiva selektivnost goriščne ravnine je tudi princip merjenja višinske smeri konfokalnega mikroskopa in razširitve žariščne globine. Nasprotno pa običajni optični mikroskop nima očitne spremembe svetlosti pred in po položaju fokusa (črtkana črta na sliki 4).
6. Visok kontrast in visoka ločljivost
Pri splošnem optičnem mikroskopu bo odbita svetloba, ki odstopa od fokusa, motila in se bo prekrivala z delom za slikanje fokusa, s čimer se bo zmanjšal kontrast slike. Nasprotno pa sta v konfokalnem optičnem sistemu razpršena svetloba zunaj žarišča in razpršena svetloba znotraj leče objektiva skoraj popolnoma odstranjeni, tako da je mogoče dobiti sliko z zelo visokim kontrastom. Poleg tega, ker gre svetloba skozi lečo objektiva dvakrat, se točkasta slika najprej izostri, izboljša pa se tudi ločljivost mikroskopa.
7. Funkcija optične lokalizacije
V konfokalnem optičnem sistemu je odbita svetloba dela, ki ni žariščna točka, zaščitena z mikroporami. Zato pri opazovanju tridimenzionalnega vzorca nastane slika, kot je nastala po rezanju vzorca z žariščem (slika 5). Ta učinek imenujemo optična lokalizacija, ki spada med posebnosti konfokalnega optičnega sistema.
8. Funkcija premikanja pomnilnika fokusa
Tako imenovano odbito svetlobo zunaj žarišča ščitijo mikropore. Po drugi strani pa lahko štejemo, da vse točke na sliki, ki jo tvori konfokalni optični sistem, sovpadajo s fokusom. Če torej tridimenzionalni vzorec premaknemo vzdolž smeri osi Z (optične osi), se bo slika nabrala in shranila v pomnilnik, zui pa bo sčasoma dobil sliko, ki jo tvori sovpadanje celotnega vzorca in fokusa . Na ta način se funkcija neskončne globine fokusa imenuje funkcija mobilnega pomnilnika.
9. Funkcija merjenja oblike površine
Pri funkciji premikanja fokusa je mogoče površinsko obliko vzorca izmeriti na brezkontakten način z dodajanjem zanke za beleženje višine. Na podlagi te funkcije je mogoče zabeležiti koordinate osi Z, ki jih tvori velika vrednost svetlosti zui v vsakem pikslu, in na podlagi teh informacij je mogoče pridobiti informacije, povezane z obliko površine vzorca.
10. Visoko natančna funkcija merjenja mikro velikosti
Enota za sprejem svetlobe sprejme enodimenzionalni slikovni senzor CCD, tako da nagib skeniranja naprave za skeniranje ne vpliva nanjo, tako da je mogoče dokončati visoko natančno merjenje. Poleg tega je mogoče odpraviti merilno napako, ki jo povzroči zamik fokusa, ker je hkrati uporabljena spominska funkcija premikanja fokusa z nastavljivo globino fokusa.
11. Analiza tridimenzionalne slike
Z uporabo funkcije za merjenje oblike površine je mogoče preprosto izdelati tridimenzionalno sliko površine vzorca. Poleg tega je mogoče izvesti tudi številne vrste analiz, kot so: merjenje površinske hrapavosti, površine, prostornine, površine, krožnosti, polmera, dolžine zui, oboda, težišča, tomografske slike, transformacije FFT, črte merjenje širine in tako naprej.
Laserski konfokalni skenirni mikroskop se lahko uporablja ne le za opazovanje celične morfologije, ampak tudi za kvantitativno analizo biokemičnih komponent v celicah, statistiko optične gostote in merjenje celične morfologije.
