Uporaba sodobnega koncepta mikroskopa pri opazovanju mikroskopskega sveta
Od starodavnih časov do danes so ljudje zasledovali višje in daljne resnice. Od oceanskih potovanj do raziskovanja vesolja, ljudje drug za drugim osvajajo velike cilje. Vendar pa makroskopski svet, ki ga ljudje vidimo s prostim očesom, ni ves svet in ga človeško oko ne vidi jasno. Prav tako privabi nešteto ljudi, da raziskujejo in sledijo.
Ne glede na makroskopske ali mikroskopske stvari, naša opazovanja temeljijo na atributih tridimenzionalnega prostora, torej tridimenzionalnosti XYZ, pri opazovanju sprememb oblike stvari pa je treba uvesti še en merilni faktor - čas T, torej Najpopolnejši način za opazovanje stvari mora biti Simultano snemanje XYZT, to je dolgotrajno fotografiranje oblike in časa, je tudi končna funkcija mikroskopa.
Po več kot 300 letih razvoja so sodobni mikroskopi predlagali koncepte, kot so ločljivost, globinska ostrina in vidno polje, ter nenehno predlagali rešitve. Mikroskopi so sprva zadovoljevali naše potrebe po opazovanju mikroskopskega sveta in nam pomagali beležiti prostor in čas mikroskopskega sveta.
Najpomembnejša stvar pri mikroskopskem opazovanju sveta je ločljivost podrobnosti in iz tega se je rodil koncept ločljivosti. Ločljivost se nanaša na najmanjšo razdaljo med dvema točkama, ki ju lahko razloči človeško oko, in velja le v dimenziji XY. V skladu z Rayleighovim kriterijem, Rayleighovim kriterijem, sta meja, ki jo normalni ljudje lahko razlikujejo, dve točki 0,2 mm na razdalji 25 cm. Ko uporabljamo mikroskop, vidimo dve točki na manjši razdalji, kar izboljša ločljivost našega opazovanja. Z nenehnim poglabljanjem sodobnih raziskav se nenehno povečujejo tudi zahteve ljudi po ločljivosti, znanstveniki pa tudi nenehno izboljšujejo ločljivost mikroskopov. Tako so na primer elektronski mikroskopi povečali ločljivost na nanometrsko raven, kar omogoča opazovanje virusov. Tehnologija ultravisokega mikroskopskega slikanja izboljša ločljivost mikroskopa z 200 nanometrov na desetine nanometrov, kar omogoča opazovanje živih celičnih organelov.
Izboljšanje ločljivosti prinaša tudi nove težave, to je zmanjšanje vidnega polja in globinske ostrine. Pri uporabi običajne metode centralne osvetlitve (metoda fotopične osvetlitve, ki poskrbi, da svetloba enakomerno prehaja skozi vzorec), je razdalja ločljivosti mikroskopa d=0,61 λ/NA, obseg valovne dolžine vidne svetlobe { {2}}nm, povprečna valovna dolžina je 550 nm, valovna dolžina pa je fiksna konstanta. Zato lahko z zvišanjem vrednosti NA dobite manjšo vrednost D, to je razdalja med dvema točkama, ki ju je mogoče razlikovati Manjša, kar ljudem omogoča, da jasno vidijo manjše predmete.
Vrednost NA je numerična apertura, ki opisuje velikost kota stožca, ki sprejema svetlobo leče, NA=n * sin , to je zmnožek lomnega količnika (n) medija med lečo in predmet, ki ga je treba pregledati, in sinus polovice odprtinskega kota (2). n je lomni količnik svetlobe medija med lečo objektiva in vzorcem. Ko je vesoljski medij predmeta mikroskopa zrak, je lomni količnik n=1. Uporaba medija z višjim lomnim količnikom kot zrak lahko znatno poveča vrednost NA. Medij za potopitev v vodo je destilirana voda, lomni količnik pa je razmerje 1,33; medij za oljni imerzijski objektiv je cedrovo olje ali druga prozorna olja, njegov lomni količnik pa je na splošno okoli 1,52, kar je blizu lomnemu količniku leče in diapozitiva. Zato je vrednost NA oljne leče višja od vrednosti zračne leče.
Kot odprtine, znan tudi kot "kot ustja zrcala", je kot, ki ga tvorita točka predmeta na optični osi leče in efektivni premer sprednje leče leče objektiva. Povečanje kota ustja ogledala lahko poveča vrednost sinusa, njegova dejanska zgornja meja pa je približno 72 stopinj (vrednost sinusa je 0,95), pomnoženo z lomnim količnikom cedrovega olja 1,52, lahko dobimo, da največja vrednost NA je približno 1,45 in če jo nadomestimo v formulo za izračun ločljivosti, lahko dobimo, da je mejna ločljivost ravnine XY običajnega mikroskopa približno 0.2um.
Vrednost NA neposredno vpliva tudi na svetlost vidnega polja mikroskopa (B). Iz formule B∝NA2/M2 lahko razberemo, da svetlost narašča s povečanjem numerične zaslonke (NA) ali z zmanjšanjem povečave objektiva (M).
Teoretično bi si morali prizadevati za najvišjo možno vrednost NA, da bi dosegli boljšo ločljivost ravnine XY in svetlost vidnega polja. Vendar ima vse dve plati. Izboljšanje ločljivosti ravnine XY bo zmanjšalo globinsko ostrino osi Z in vidno polje opazovanja.
Mikroskopi običajno gledajo pogled navpično navzdol. Ko sta konveksna in konkavna lega na površini predmeta, opazovana znotraj premera vidnega polja, jasno vidna, je višinska razlika med konveksno točko in konkavno točko globinska ostrina. No, za mikroskope velja, da večja kot je globinska ostrina, tem bolje. Večja kot je globinska ostrina, boljše in bolj jasne tridimenzionalne slike lahko dobite pri opazovanju površine neravnih predmetov. Velika globinska ostrina nam pomaga opazovati mikroskopski svet v navpični smeri. To je informacija o osi Z v tridimenzionalni obliki XYZ.
Globinska ostrina je globina sprednjega in zadnjega prostora, ki ustreza jasni sliki na ravnini slike: dtot=(λ*n)/NA plus n/(M∗NA) * e, dtot: globinska ostrina , NA: numerična apertura, M: skupna povečava, λ: valovna dolžina svetlobe (običajno λ=0.55um), n: lomni količnik medija med vzorcem in lečo objektiva (zrak: n{{3 }}, olje: n=1.52) Po tej formuli lahko vemo, da je globinska ostrina osi Z obratno sorazmerna z vrednostjo NA ravnine XY.
Na vidno polje poleg globinske ostrine vpliva tudi vrednost NA. Prostorsko območje, ki ga lahko vidimo, ko instrument nepremično gleda v točko, je vidno polje. Njegov izračun je neposredno povezan s povečavo leče objektiva. Dejanski premer vidnega polja, ki ga vidimo z opazovanjem, je enak premeru vidnega polja, deljeno s povečavo leče objektiva, bo okular pokazal ustrezno vidno polje, kot je 10/18, to je povečava je 10-kratna, premer vidnega polja pa 18 mm. Zato je pri določanju okularja večja kot je povečava, manjše je opazovano vidno polje.
Ločljivost ravnine XY je analiza lokalnih podrobnosti, vidno polje pa določa naš obseg opazovanja vzorca. Večje kot je vidno polje, boljše je, vendar omejeno s sedanjo tehnologijo, moramo za pridobitev dobrih vrednosti NA uporabiti objektive z visoko močjo, zato imajo vidno polje in vrednosti NA posredno negativno korelacijo.
